| 研究課題/領域番号 |
15K07728
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
杉谷 博士 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20050114)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 線維芽細胞 / 炎症 / TNF-α / プロスタグランジンE2 / シクロオキシゲナーゼ2 / MAPキナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
創傷治癒は，受傷の直後に生じる出血と凝固止血に始まり，その後の炎症反応による壊死組織・細菌等の除去，に公家組織の形成，再上皮化，マトリクス形成と続き，組織修復の終了後は，それ以上の炎症反応や細胞増殖を抑制して定常状態に戻るという複雑な生物学的事象である。そのため，炎症メカニズムを明らかにすることは皮膚機能再生に重要なことと考えられる。皮膚の創傷治癒の場合，最終的な組織修復を担うのは線維芽細胞と表皮角化細胞である。そこで，初代培養されたイヌ皮膚由来線維芽細胞を用い，免疫や炎症に関与するサイトカインの一種であり，生体防御において重要な役割を担っている腫瘍壊死因子α（TNF-α）の炎症メカニズムに関与する細胞内シグナル伝達について検討した。イヌ皮膚由来線維芽細胞をTNF-αで刺激すると，時間依存性および濃度依存性に炎症に関わるプロスタグランジンE2（PGE2）の放出が確認された。また，TNF-α刺激された細胞において，PGE2産生に関わるとされるシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）のmRNAおよびタンパク質発現が促進された。MAPキナーゼ系の関与を阻害剤で検討したところ，ERKおよびp38阻害剤によりTNF-αの効果は抑制された。さらに，TNF-α刺激された細胞においては，ERK1/2およびp38のリン酸化が認められ，これもそれぞれの阻害剤で阻害された。一方，サイトカイン刺激で活性化する転写因子と考えられているNuclear factor κB（NF-κB）阻害剤の効果は認められなかった。イヌ皮膚由来線維芽細胞において，他の炎症性サイトカインであるインターロイキン1β（IL-1β）誘導性COX-2発現にはによるERKの活性化が関与することを既に報告したが，TNF-α誘導性のCOX-2発現においては異なる因子が関わることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究はイヌ皮膚由来線維芽細胞における炎症制御に対するセラミド代謝物の効果を明らかにすることを目的としているため，初めにイヌ皮膚由来線維芽細胞における炎症性サイトカインを用いた炎症に関わる細胞内シグナルの検討を進めている。別の炎症性サイトカインのであるIL-1β 刺激を行うと，PGE2放出が認められ，PGE2合成に変わるCOX-2 mRNAの発現が上昇するが，この場合のMAPキナーゼはMEK/ERKの活性化が優位に関わっていることを既に報告している。また，このMEK/ERK活性化には，従来，転写因子と考えられていたNF-κB が転写調節を介さずに関わることを明らかにした。しかし，今回の結果は，同様な炎症性サイトカインであるTHF-α刺激された細胞においては，MEK/ ERKの活性化に加えて，p38の活性化が認められたことから，リガンドの差によるMAPキナーゼ経路の活性化は異なることが考えられる。さらに，TNF-α刺激によるNF-κB阻害剤の効果は認められなかったことから，MEK/ERK 経路やp38の上流には異なる活性化因子が関わることが考えられる。以上の結果は，イヌ皮膚由来線維芽細胞における炎症メカニズムは極めて複雑なシグナル構成がなされていることを意味するものであり，この点の解明が必要と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
近年，我々の研究において，イヌおよびネコの炎症メカニズムを初代培養線維芽細胞を使用して検討する中で，従来考えられていた炎症性サイトカイン誘導性のCOX-2発現とPGE2産生の過程に，MAPキナーゼシグナル内でのクロストークが存在することを明らかにした。すなわち，JNKのサブタイプであるJNK1によるERK1/2活性化調節が明らかとなった。そのため，初代培養イヌ皮膚由来線維芽細胞を用いて，炎症性サイトカインであるIL-1βやTNF-αの作用メカニズムを明らかにするために，IL-1β刺激によるNF-κBとERKの相互作用，また，TNF-α刺激によるERKとp38の相互作用につき阻害剤と特異的抗体を用いた免疫沈降法を用いて検討を行うことでMAPキナーゼ経路内のクロストークについて検討を行う。さらに，MAPキナーゼ系のリン酸化酵素のアイソフォームの役割や，NF-κBのアイソフォームの発現とその役割についても，すでに確立されているsiRNAを用いたノックダウンにより，COX-2やPGE2放出を指標に，機能との関連も含めて検討を行う。その後に，得られたシグナル経路に対する効果も含めて，セラミド代謝物であるスフィンゴシン，スフィンゴシン 1-リン酸，セラミド-リン酸およびセラミドによるMAPキナーゼおよびNF-κBの活性化の関与について検討を進める。以上の結果より，目標としているイヌ皮膚由来線維芽細胞における炎症制御に対するセラミド代謝物の効果を考察する。
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