| 研究課題/領域番号 |
15K07739
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| 研究機関 | 岩手大学 |
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研究代表者 |
山崎 真大 岩手大学, 農学部, 教授 (40322846)
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| 研究分担者 |
今井 正樹 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (30333363)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Babesia gibsoni / ジミナゼン・アセチュレート / 薬剤耐性 / 次世代シークエンサー / RNAseq |
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| 研究実績の概要 |
イヌに感染する赤血球内寄生原虫であるBabesia gibsoniのジミナゼン製剤耐性株について、その耐性メカニズム解明を目的として平成27年度は以下の研究を実施した。
１．申請者らが以前作成したジミナゼン・アセチュレート（DA）耐性B. gibsoniについては、培養系にて維持していたものの、申請者の異動の際に元の所属研究機関である北海道大学に残してきたことから、同じ方法を用いてDA耐性B. gibsoniの作成を試みた。北海道大学では遺伝的に特殊でB. gibsoniがよく増殖するイヌ赤血球を培養に用いていたが、岩手大学ではその赤血球は利用できなかったため、ビーグル犬より得られる正常イヌ赤血球を用いて実験を行ったところ、この赤血球ではDA耐性株の作成が困難であることが明らかになった。DAに対して高い抵抗力をもつ原虫を分離できたものの、以前作成したDA耐性株よりもDAに対する感受性が高いことが予想される。このDA耐性株の作成については本年度も引き続き検討を行い、培養条件の見直しなどを行って早急に達成する予定である。
２．DAを含まない培養液を用いて培養している野生株B. gibsoniについてクローン化を行いDA感受性株を6株得た。それらに対するDAの50%阻害濃度（IC50）を測定したところ、平均34.0 ng/mLであり、これより高いIC50を呈する株をDA耐性株とするとととした。さらに、このDA感受性株から総RNAを抽出し、これをサンプルとして次世代シークエンサーを用いてRNAseqを行った。この手法で得られたDNA感受性株における遺伝子の発現量をコントロールとして、今後DA耐性株と比較していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成27年度は、研究の要となるDA耐性のB. gibsoniをまず作成する予定であったが、これまでと同じ方法では上手く作成できず、難航しており、これが研究の遅れの原因となっている。これまでの方法と異なる点として、B. gibsoniの培養に利用しているイヌ赤血球の種類が異なっており、これが薬剤耐性原虫の作成を困難にしていると考えられる。しかしながら、B. gibsoniがよく増殖するイヌ赤血球は遺伝的に特殊な赤血球であり、一部の家系の柴犬や秋田犬が保有しているものでありこのようなイヌを探すこと、さらに実験動物として飼育することは容易ではない。この赤血球の特長は、赤血球内に多量の栄養素、抗酸化物質を含んでいることであり、培養条件を見直すことで同様の条件を達成できるのではないかとの観点から現在、培養液を変更したところDAを含んだ培養液中でもB. gibsoniが順調に増殖していることから、DA耐性株が作成されると期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
高濃度のDAを含む培養液で培養可能なB. gibsoniが得られれば、それらのIC50を求め、DA耐性株であると確認し、さらにこれらをクローン化してDA耐性株として維持する。その上で、これらの総RNAを抽出してサンプルとし、次世代シークエンサーによる解析を行った上で平成27年度に解析したDA感受性株のデータと比較することでDA耐性株とDA感受性株の遺伝子発現の違いを検索し、DA耐性メカニズムの解明につなげる予定である。
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