| 研究課題/領域番号 |
15K07745
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
岩田 祐之 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (40193750)
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| 研究分担者 |
前田 健 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (90284273)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | α1酸性糖蛋白 / プロカルシトニン / 急性期蛋白 / 敗血症 / ELISA |
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| 研究実績の概要 |
牛プロカルシトニン（PCT）について、大腸菌による組換え蛋白を発現させ、精製した。この精製Trx-His-boPCTをマウスに免疫し、抗牛PCTモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ5クローン（1C11, 1A8, 1A3, 1E12, 2E4）を得た。これらの抗体のアイソタイプを確認したところ、免疫グロブリン重鎖は1C11がIgG1、残る4種がIgG2bであり、軽鎖は全てκ鎖であった。これらの抗体のエピトープ解析をウエスタンブロット法およびELISA法を用いて行った結果、2E4はN末端領域（アミノ酸26-96）を認識したのに対し、残る4種の抗体はC末端領域（87-143）を認識した。認識するエピトープの異なる2E4および1A8について、抗体を精製し、2E4をビオチン化することで、1A8を補足抗体、2E4を検出抗体とするサンドウィッチELISAによるboPCT定量系を確立した。
一方、牛α1酸性糖蛋白（AGP）については、組換え蛋白 フラグメントを用いたエピトープ解析の結果、6 種の抗牛AGP mAb のうち、4 種(3C5、2G3、1B1-1、2B5-1)はすべて C 末端領域 (アミノ酸 169-202)を認識することが明らかとなった。一方、残りの 2 種(2A4-2、2C11-6) については、ウエスタンブロットではどの boAGP フラグメントにも反応しなかったため、 boAGP の立体構造を認識する可能性が示唆されたが、サンドイッチELISAによる定量法の確立には至らなかった。尚、直接 ELISA 法による定量では、0.125 ~ 1.5 μg/mL の範囲で boAGP を測定することが可能であった。
その他、難治性疾患としてイバラキウイルス感染の複製機構に関する所見から、急性期蛋白発現の際の小胞体ストレスとの関係に繋がる知見が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
牛プロカルシトニンについては、２種類のエピトープを認識するモノクローナル抗体の作製に成功し、サンドイッチELISAが可能となった。一方、α1酸性糖蛋白については２種類のエピトープを認識するモノクローナル抗体が得られたが、サンドイッチELISAを確立するに至っておらず、２つのエピトープが近接することが原因と考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
細菌感染症の評価に有用な急性期蛋白の１つである牛プロカルシトニンについては、２種類のエピトープを認識するモノクローナル抗体の作製に成功し、サンドイッチELISAを確立した。今後は、エピトープの探索、標準品の選定、各種症例の血中濃度測定を行い、その意義について検討し、特許取得を目指す。牛α1酸性糖蛋白については、取得しているモノクローナル抗体のエピトープは異なるものの、構造上近接しており、親和性に問題があることが判明したため、サンドイッチELISAは困難であることから、今後はビアコアを用いた方法を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に予定していたプロカルシトニンおよびα1酸性糖蛋白に対するモノクローナル抗体の作製が予定より時間を要し、合成ペプチドを用いたエピトープ解析が実施できず、標準品を作製できなかった。そのため、これを用いた機能解析も実施できず、次年度に持ち越すこととなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
組換え蛋白を用いたエピトープ解析の結果からペプチド合成を行い、これを用いてより詳細な解析を実施する。合わせて、標準蛋白を作製または抽出してELISAの標準抗原の作製、機能解析に用いる予定である。
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