| 研究課題/領域番号 |
15K07752
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
枝村 一弥 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (80366624)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脊髄再生 / 線維芽細胞増殖因子 / 犬 / 骨髄間質細胞 / ニューロン分化 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、昨年度に当研究事業で精製に成功した犬由来遺伝子組換えbFGF（rc-bFGF）を用い、犬の骨髄間質細胞（BMSCs）のニューロン分化へ与える影響について検討した。本検討では、未分化群、rh-bFGF群、rc-bFGF群、対照群の4群に分け、ニューロン様形態へと変化した細胞の割合を算出した。次いで、ニューロン分化誘導後のMAP2、NEFH、ENO2、TUBB3、NESの発現量を定量的に評価した。さらに、ニューロン分化誘導後の細胞を用いてNeurofilament-Lに対する蛍光免疫染色を行った。犬BMSCsはbFGFの刺激によりニューロン様の形態へと変化した。ニューロン様細胞は、rc-bFGF群において最も早く出現し、形態変化率も最も高かった。ニューロン分化誘導前後におけるmRNAの発現を比較したところ、rc-bFGF群とrh-bFGF群においてNEFHを中心にニューロンマーカーの発現が増加していた。これらの発現に、rc-bFGF群とrh-bFGF群との間に差は認められなかった。蛍光免疫染色を行ったところ、bFGFで刺激をした細胞の一部においてNeurofilament-L陽性細胞が認められた。本検討では、精製したrc-bFGFを用いて犬BMSCsを刺激したところ、ニューロン様の形態へと変化し、ニューロンマーカーであるmRNAおよび蛋白の発現が認められた。また、従来からニューロン分化の検討に用いられてきたrh-bFGFと結果にほとんど差が認められなかった。これらの結果から、今回精製したrc-bFGFは犬の神経再生医療へ応用できる可能性が示唆された。
本年度は、さらにMRIを用いた脊髄トラフトグラフィーに関する検討も行った。しかし、本学保有の機器の限界もあり理想的な画像を得ることはできなかった。こちらに関しても、継続的に検討を続けていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度の実験では、rc-bFGFを用いて犬BMSCsをニューロンへと分化させて様々な解析を行った。今回の検討で、RT-PCRを用いてニューロンへ分化させた後のmRNAの発現を確認したところ、一部のマーカーで再現性の乏しい結果が出たため追随試験をなっている。さらに、その後に行う予定であったCaイメージングを用いた電気生理学的な検討に至ることができなかった。このように、一部の検討で進行がやや遅れているが、既に本検討を継続的に行っており、前向きな結果が出始めている。一方として、新たなサイトカインの創生も開始しており、従来の予想以上の成果も得られつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) 損傷脊髄の組織培養モデルを用いたbFGFの脊髄再生効果の検証
正常犬の脊髄を挫滅してから摘出し、それらの脊髄を薄切する。次いで、薄切した脊髄をコラーゲンシート培養皿に静置し組織培養する。この時に、従来の培養液へrc-bFGFのみを添加し培養する群（bFGF群）とGFPでマーキングした犬BMSCを共培養する群（BMSC群）の2群を設定し、細胞の定着性を検討する。培養3、7、10、14日目の培養液交換時に倒立顕微鏡にて形態を観察する。また、同時期に培養脊髄からmRNAおよび蛋白を抽出し、ニューロン（NF-LおよびNSE）やグリア（GFAP）マーカーの発現の増減をRT-PCRとWestern blotting法にて確認する。また、培養14日後に各群の培養脊髄を中性緩衝ホルマリン液にて固定し、病理組織学的な検討を行う。その際には、ブロモデオキシウリジン(BerU)にて予め標識しておき細胞増殖能を各群で比較する。それと同時に、ニューロンマーカー（NF-LおよびNSE）またはグリアマーカー（GFAP）に対する抗体を用いて共染色してから共焦点レーザー顕微鏡にて観察を行い、いずれの系統の神経が再生しているかを評価する。
2) 正常犬でのrc-bFGFの安全性および投与経路の検討
本検討では、正常ビーグル犬を用いて当研究室で得られたrc-bFGFの安全性を確認する。本検討は、日本大学動物実験委員会の承認を得てから行う。rc-bFGFを滅菌した生理食塩水に混じて、正常犬の静脈内に投与する。各濃度で投与を行い、液体クロマトグラフィーやELISAを用いて血中および脳脊髄液中の濃度を測定し半減期（th1/2）を確認する。それにより、理想の投与量の決定を行う。また、副反応の有無も確認する。さらに、本検討ではrc-bFGFの硬膜内投与も行い、静脈内投与と硬膜内投与のいずれが有効かについても検討する。
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