食物アレルギーにおける食物アレルゲンを発現する乳酸菌ワクチン研究

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K07756
• 研究機関: 麻布大学
• 研究代表者: 阪口 雅弘 麻布大学, 獣医学部, 教授 (20170590)
• 研究分担者: 五十君 静信 国立医薬品食品衛生研究所, 食品衛生管理部, 客員研究員 (70212743)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 食物アレルギー / イヌ / オボアルブミン / アレルゲン / 乳酸菌

研究実績の概要

H28年度は経口接種において免疫系に認識されるOVA（オボアルブミン）量を検討するため、３週間にわたってOVAタンパクと乳酸菌を経口投与後、OVAとアラム・アジュバントのマウスの腹くう内投与を２回行って有効なOVA量の検討を行った。経口投与したOVA量は1μgから 10mgであった。最終的なOVAとアラム・アジュバントの腹くう内投与１週間後にマウスから採血を行い、OVA特異的IgEの測定をELISA法で行った。OVA特異的IgEの抑制効果は用量依存的な抑制が見られ、10μgのOVA経口投与した群でもOVA特異的IgE抗体の抑制が認められた。この結果によって、OVA発現乳酸菌ワクチンにおいて、10μg以上のOVAの含有量が必要と考えられた。また、H28年度は食物アレルギーを示す８２頭のイヌにおけるOVAに対するIgE抗体の反応性をELISA法を用いて検討した。最初に一般的な食物アレルゲンである卵白の粗抗原に対するIgE抗体を測定したところ、82頭中8頭(9.8%)が陽性を示した。さらにこの粗抗原に対するIgE陽性の8頭においてOVA特異的IgE抗体が存在するか調べたところ、8頭中6頭(75.0%)はOVAに陽性を示した。上記のELISA法で得られた結果の検証のため、ウェスタンブロット法を行った。ウェスタンブロットにおいてもOVA特異的IgE抗体が検出された。この結果によって、OVAがイヌの主要な卵白精製抗原だということが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

H28年度において経口接種において免疫系に認識されるOVA（オボアルブミン）量を検討するため、OVAタンパクと乳酸菌を経口投与後、OVAとアラム・アジュバントのマウスの腹くう内投与を有効なOVA量の検討を行った。この結果によって、OVA発現乳酸菌ワクチンにおいて、10μg以上のOVAの含有量が必要と考えられた。現在、OVA発現乳酸菌ワクチン中に含まれるOVA量はngレベルでμgレベルには達していない。また、OVA発現乳酸菌ワクチンを自然発症の食物アレルギー犬に臨床応用を検討するための基礎的検討としてアレルギー犬の血清中のOVA特異IgE抗体の測定を行った。食物アレルギー犬８２頭中８頭でOVA特異IgE抗体が検出された。今後、これらの自然発症の食物アレルギー犬での研究の可能性が開かれた

今後の研究の推進方策

H29年度では１回の投与量で10μg以上のOVA発現量を目安にOVA産生遺伝子組換え乳酸菌の作製をやり直す予定である。さらに並行して大腸菌でOVA組み換え体を作製してそのOVAを乳酸菌の表面に結合させるOVA結合乳酸菌ワクチンの作製も併せて行う予定である。この方法であれば、十分量（10μg以上）のOVAを乳酸菌に結合させたワクチンが比較的簡単に作製できると考えられる。また、本研究において、初めて自然発症の食物アレルギー犬においてOVAがアレルゲンになっていることが明らかになった。OVAと乳酸菌を組み合わせた食物アレルギーワクチンにおける臨床応用に可能性も開かれた。本年度もさらに食物アレルギー犬におけるOVAの反応性を詳しく解析する予定である。

次年度使用額が生じた理由

本年度は十分な試薬・消耗品を購入して年度内でも十分に使用可能であることがわかった。また、次年度（110万円）は本年度(150万円）に比べ、大幅に研究予算が減少するため、次年度に向けて試薬・消耗品が十分に購入できるように予算の繰り延べを希望します。

次年度使用額の使用計画

繰り延べした24739円は次年度の研究代表者である阪口の試薬・消耗品費（40万円予定）と合わせてに試薬・消耗品費に使用する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] ウィスコンシン 大学(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: ウィスコンシン 大学
• [雑誌論文] Identification of the PLA2G6 c.1579G>A missense mutation in papillon dog neuroaxonal dystrophy using whole exome sequencing analysis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsuboi, M., Watanabe, M., Nibe, K., Yoshimi, N., Kato, A., Sakaguchi, M., Yamato, O., Tanaka, M., Kuwamura, M., Kushida, K., Ishikura, T., Harada, T., Chambers, J.K., Sugano, S., Uchida, K., and Nakayama, H.
  • 雑誌名: Plos one 巻: 12 ページ: 1-17
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0169002
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Characterization of Pseudomonas aeruginosa phage KPP21 belonging to family Podoviridae genus N4-like viruses isolated in Japan. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shigehisa, R., Uchiyama, J., Kato S, Takemura-Uchiyama, I, Yamaguchi, K., Miyata, R., Ujihara, T., Sakaguchi, Y., Okamoto, N., Shimakura, H., Daibata, M., Sakaguchi, M., and Matsuzaki, S
  • 雑誌名: Microbiology and Immunology 巻: 60 ページ: 64-67
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12347
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cross-reactivity between major IgE core epitopes on Cry j 2 allergen of Japanese cedar pollen and relevant sequences on Cha o 2 allergen of Japanese cypress pollen. (2016)
  • 著者名/発表者名: Miyaji, K., Okamoto, N., Saito, S., Yasueda, H., Takase, Y., Shimakura, H., Saito, S., and Sakaguchi, M.
  • 雑誌名: Allergology and International 巻: ６５ ページ: 286-292
  • DOI: 10.1016/j.alit.2016.01.003
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analyses of short-term antagonistic evolution between Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 and phage KPP22 belonging to family Myoviridae genus PB1-like viruses. (2016)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama, J., Suzuki, M., Kato, S., Miyata, R., Nasukawa, T., Yamaguchi, K., Hirayama, R., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Shimakura, S., Murakami, H., Sakaguchi, Y., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.:
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 82 ページ: 4482-4491
  • DOI: 10.1128/AEM.00090-16
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Screening of KHP30-like prophage in the genome of Helicobacter 4 pylori strain NY40. (2016)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama, J, Takemura-Uchiyama, I., Kato, S., Takeuchi, H., Sakaguchi, Y., Ujihara, T., Daibata, M., Shimakura, H., Okamoto, N., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • 雑誌名: FEMS Microbiology Letters 巻: 363 ページ: 1-9
  • DOI: 10.1093/femsle/fnw157
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] IgE reactivity to hen’s egg white allergens in dogs with cutaneous adverse food reactions. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimakura, H., Saito, T., Uchiyama, J., Miyaji, K., Fujimura, M., Masuda, K., Okamoto, N., DeBoer, D.J., Sakaguchi, M.
  • 雑誌名: Veterinary Immunology and Immunopathology 巻: 177 ページ: 52-57
  • DOI: 10.1016/j.vetimm.2016.06.003
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Inefficient viral replication of bovine leukemia virus induced by spontaneous deletion mutation on G4 gene. (2016)
  • 著者名/発表者名: Murakami, H., Uchiyama, J., Nikaido, S., Sato, R., Sakaguchi, M., Tsukamoto, K.
  • 雑誌名: Journal of General Virology 巻: 97 ページ: 2753-2762
  • DOI: 10.1099/jgv.0.000583
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nationwide distribution of bovine influenza D virus infection in Japan. (2016)
  • 著者名/発表者名: Horimoto, T., Hiono, T., Mekata, H., Odagiri, T., Lei, Z., Kobayashi, T., Norimine, J., Inoshima, Y., Hikono, H., Murakami, K., Sato, R., Murakami, H., Sakaguchi, M., Ishii, K., Ando, T., Otomaru, K., Ozawa, M., Sakoda, Y. and Murakami, S.
  • 雑誌名: Plos one 巻: 11 ページ: 1-7
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0163828
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Study of adsorption of AHJD-like phages infecting Staphylococcus aureus (2017)
  • 著者名/発表者名: Jumpei Uchiyama, Kenshi Kurokawa, Iyo Takemura-Uchiyama, Takako Ujihara, Yoshihiko Sakaguchi, Masahiro Sakaguchi, Shigenobu Matsuzaki
  • 学会等名: 第９０回日本細菌学会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2017-03-19 – 2017-03-21
• [学会発表] 犬アトピー性皮膚炎症例におけるEnterococcus faecalis FK-23投与と臨床症状の変化にする研究 多施設実施二重盲検無作為プラセボ比較試験 (2017)
  • 著者名/発表者名: 大隅尊史、阪口雅弘、嶋田貴志、辻本元
  • 学会等名: 第20回獣医皮膚科学学会
  • 発表場所: 大宮
  • 年月日: 2017-03-11 – 2017-03-12
• [学会発表] DogFilerを用いた犬種推定法の検討 (2016)
  • 著者名/発表者名: 旭 愛、岡本憲明、関口和正、阪口雅弘、武内ゆかり、松田秀明
  • 学会等名: 第22回日本法科学技術学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-11-10 – 2016-11-11
• [学会発表] Serological survey reveals the wide distribution of bovine influenza D virus infection in Japan (2016)
  • 著者名/発表者名: Taisuke Horimoto, Tomoha Odagiri, Zhihao Lei, Tomoya Kobayashi, Maiko Endo, Akiko Uema, Hirohisa Mekata, Junzo Norimine, Kenji Murakami, Hironobu Murakami, Masahiro Sakaguchi, Kazunori Ishii, Yasuo Inoshima, Makoto Ozawa, Takahiro Hiono, Yoshihiro Sakoda, Benjamin Hause, Shin Murakami
  • 学会等名: 第64回日本ウイルス学会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2016-10-23 – 2016-10-25
• [学会発表] ダニアレルゲンワクチン標準化に関する日本アレルギー学会タスクフォース報告 (2016)
  • 著者名/発表者名: 高井敏朗、岡本美孝、大久保)公裕、永田真、阪口雅弘、福冨友馬、齋藤明美、安枝、浩、増山敬祐
  • 学会等名: 第６５回日本アレルギー学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2016-06-17 – 2016-06-19
• [図書] 有害微生物の制御と管理 (2016)
  • 著者名/発表者名: 阪口雅弘
  • 総ページ数: 664
  • 出版者: テクノシステム