| 研究課題/領域番号 |
15K07774
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| 研究機関 | 京都産業大学 |
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研究代表者 |
加藤 啓子 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90252684)
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| 研究分担者 |
中山 喜明 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (40512455)
黒坂 光 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90186536)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | シアル酸転移酵素 / シアル酸 / てんかん / うつ，不安症 / 糖鎖構造 / 視床 / 扁桃体 / 疾患モデル |
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| 研究実績の概要 |
てんかん患者における，うつ，不安障害，統合失調症といった精神疾患の出現は，一般の集団に比べて３倍高いことが知られている。研究代表者は，難治てんかんの５０％を占める側頭葉てんかんのモデルマウスを用いた研究より，辺縁系神経細胞におけるシアル酸転移酵素（ST3Gal4）の発現が，てんかん発作誘導に必須である一方で，その欠失は，うつ，不安障害，統合失調症様症状を引き起こすことを明らかにしてきた。このST3Gal4がシアル酸を付加する分子が，てんかんから，うつ，不安障害，統合失調症様症状の発症に関わると考え，本研究では，シアル酸標的分子を同定し，てんかんとその併存症の発症に関わる分子シグナルの全貌をめざしている。
本研究では当初，ST3Gal4がシアル酸を付加するタンパク質を検出し同定することを予定していた。そこで，ST3Gal4は糖鎖構造にシアル酸を修飾する酵素であることから，ST3Gal4の発現を示す神経細胞が特異的に提示する糖鎖構造を検出・同定し，その後，その特異的糖鎖構造を持つシアル酸化糖タンパク質をスクリーニングすることとした。これまでにST3Gal4-KOマウスと野生型の視床と海馬を比較したところ，異なるO-グリカン糖鎖構造を検出した。特にST3Gal4の発現の高い視床において特異的な発現を示した。また，N-グリカン糖鎖及び，シアル酸を持つスフィンゴ脂質であるガングリオシドについても，ST3Gal4-KOマウスと野生型の視床と海馬を比較したところ差を示す糖鎖構造はなかった。 以上のことから平成２８年度からは，ST3Gal4の発現する視床の神経細胞が提示するO-グリカン糖鎖構造を持つ糖タンパク質のスクリーニングをスタートさせることとする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究計画は，ST3Gal4によるシアル酸受容体基質分子を同定し，てんかん～うつ・不安障害の発症の原因であるシアル酸化標的分子を見つけ出し，その分子が創薬のターゲットになりうることを証明することである。平成27年度の当初の研究計画では，①アジド糖ManNAzを利用したダブルクリック反応による検出系により，脳内のシアル酸化標的分子（受容体基質）を抽出・同定し，シアル酸化標的分子の同定を目指すことであった。これまでに，ST3Gal4遺伝子欠損マウス（KO）の視床と小脳にManNAz（28 nmol）を2日に1度，計8回注入したのち，マウスを安楽死させ脳を取り出し，ドライアイス下で凍結した。また，扁桃体に電極を挿入し微弱な刺激を導入することで，てんかん発作を誘導する，側頭葉てんかんモデルマウスの海馬にもManNAz（28 nmol）を2日に1度，計8回注入し，同様に新鮮凍結脳を調整した。当初の計画では，ST3Gal4-KOマウスと野生型のみManNAzを注入し，平成27年度中に質量分析まで進める予定であった。しかしながら，当初ST3Gal4を発見した経緯も含め，側頭葉てんかんモデルマウスの海馬にもManNAzを注入した。それゆえ，平成27年度は，新鮮凍結脳を調整するにとどまった。
平成28年度には，② シアル酸転移酵素とCMP-シアル酸を用いたアフィニティー精製法により，ST3Gal4発現神経領域から糖タンパク質を抽出し，受容体基質タンパク質を同定する予定である。そこで平成27年度に，アフィニティー精製時の溶出物質に利用できる，ST3Gal4酵素がシアル酸を負荷する特異的糖鎖構造を決定した。この糖鎖構造を合成することで，平成28年度に予定するアフィニティー精製時の糖鎖溶出が可能となる。以上のことから平成27年度は，順調に研究は進行し，結果を出すことができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度の当初の研究計画では，①アジド糖ManNAzを利用したダブルクリック反応による検出系により，脳内のシアル酸化標的分子（受容体基質）を抽出・同定し，シアル酸化標的分子の同定を目指すことであった。上述した通り，ST3Gal4遺伝子欠損マウス（KO）の視床と小脳，さらには側頭葉てんかんモデルマウスの海馬にもManNAz（28 nmol）を注入し，新鮮凍結脳を調整してきた。平成28年度には，各新鮮凍結脳をスライスし，ST3Gal4の発現神経核をマイクロナイフで切り出す予定である。切り出した神経核から糖タンパク質を抽出し，ManNAzのアジド基はアルキン基を持つビオチンと共有結合させる（クリック反応）。その後，アビジン樹脂（磁石）を用いて，糖たんぱく質をアフィニティー精製する。SDS-PAGE電気泳動を行ったのち，ST3Gal4-KO，野生型，てんかん，手術後未刺激マウス間で糖タンパク質のバンドを比較し，差のあるバンドについて質量分析を行い，受容体基質を同定する予定である。
平成28年度には，② シアル酸転移酵素とCMP-シアル酸を用いたアフィニティー精製法により，ST3Gal4発現神経領域から糖タンパク質を抽出し，受容体基質タンパク質を同定する予定である。上述した通り，平成27年度にアフィニティー精製時の溶出物質に利用できる，ST3Gal4酵素がシアル酸を負荷する特異的糖鎖構造を決定した。この糖鎖構造を合成することで，平成28年度に予定するアフィニティー精製により基質受容体を部分精製できる。部分精製した溶出糖タンパク質をSDS-PAGE電気泳動した後，ST3Gal4-KO，野生型，てんかん，手術後未刺激マウス間で糖タンパク質のバンドを比較できる。差のあるバンドについて質量分析を行い，受容体基質を同定する予定である。以上，平成２８年度には，①，②より得られた質量分析の結果を突き合わせることにより，真の基質受容体の絞り込みをおこなう予定である。
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