| 研究課題/領域番号 |
15K07782
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
中村 京子 順天堂大学, 医学部, 助教 (90578858)
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| 研究分担者 |
濱田 耕造 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (00311358)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | カルシウムシグナリング / ムスカリニックアセチルコリン受容体 / 光刺激 / 膵外分泌機能 |
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| 研究実績の概要 |
これまで申請者らは、膵臓の外分泌機能に関与しているムスカリニックアセチルコリン受容体(mACh)のタイプ1と3では、それぞれを介したアゴニスト(acetylcholine, ACh) 誘発性の細胞内Ca2+動態に顕著な違いがあり、それには各タイプのC末端と細胞内第3ループ領域が関与していることを報告してきた。これは、本研究の目的受容体作成に当たり、発現細胞同定のための赤色蛍光タンパク質を、それぞれのmAChRのC末端に付加しても完全に再現性が見られた。
膵腺房細胞における消化酵素の分泌には、細胞内のCa2+濃度の上昇が必須である。そのためにはmAChRのタイプ1と3がお互いうまく干渉しあって適切なCa2+の濃度上昇をコントロールし、酵素分泌を制御していることが考えらえるが、タイプ1と3を介するCa2+の動態がどのように酵素分泌を制御しているかは今までわかっていなかった。しかし従来の薬物刺激で細胞内のCa2+上昇を誘発する方法ではこの関連性を調べることは困難である。そこで薬物刺激ではなく、光刺激によって細胞内のCa2+上昇パターンを制御できるツールの探索を最初の目的とした。光感受性タンパク質とmAChタイプ1および3のキメラ受容体を作成して培養細胞に発現させ、光刺激によって細胞内Ca2+上昇パターンを制御することにより、酵素分泌との関連性の解析につなげて行く。まずは光感受性タンパク質の相当部分と、ACh誘発性の細胞内Ca2+濃度上昇パターンの違いを引き起こす、mAChRのタイプ1および3のC末端と細胞内第3ループ領域を置換したキメラ受容体を作成した。今後はこれらの受容体を介する細胞内Ca2+の動向を基に改変し、最適ツールを作成していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
27年度は所属大学で再編に伴う大規模な研究室移動が行われたが、予定通りに移設が進まなかったことから、測定システムのセットアップが当初の予定よりもかなり遅くなってしまった。その間にコンストラクトの作成は進めていたので、順次株化細胞に発現させ、光刺激による細胞内Ca2+イメージングを開始した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は探索したツールを用いて、より精度の高い光刺激による細胞内Ca2+濃度上昇パターンを誘導できる条件を検討して行く。そして消化酵素の産生・分泌可能な膵臓由来細胞に導入し、Ca2+動態-消化酵素分泌連関の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
27年度は研究室の移転予定時期の遅延等、イメージングシステムのセットアップに遅れが出たこと、及び開始したキメラ受容体作成の条件検討に時間を要したため学会発表まで至らなく、旅費の一部、およびその他分が次年度に持ち越しになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
イメージングシステムのセットアップも概ね整ったので、次年度はツールの探索を早い段階で目途を付け、細胞内Ca2+上昇誘導による酵素分泌解析に着手するために使用する。また得られた結果を学会等で発信していくために、旅費分も計上する。
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