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2015 年度 実施状況報告書

病原タンパク質の除去を目指した基質・細胞内局在改変型ユビキチンリガーゼの開発

研究課題

研究課題/領域番号 15K07840
研究機関大阪大学

研究代表者

立松 健司  大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (00322743)

研究分担者 黒田 俊一  大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (60263406)
藤井 郁雄  大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70189984)
研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード病原タンパク質 / タンパク質分解 / ユビキチンシステム / ドラッグデリバリーシステム / 一細胞
研究実績の概要

病原タンパク質を選択的に排除する改変型ユビキチンリガーゼのモデル実験系として、抗ヒト血清アルブミン(HSA)一本鎖抗体(Fv)とRBCK1の融合タンパク質Fv-RBCK1を大腸菌で発現精製して、in vitroにおいてHSAが特異的にユビキチン化されるかどうか検討した。まずFv-RBCK1を大腸菌において発現、精製した。次にin vitroにおいてHSAを基質としてユビキチン化実験を行ったが、HSAのユビキチン化が観察されなかった。
任意の病原タンパク質をターゲティングするユビキチンリガーゼの基質認識部位として、Protein Aの抗体結合ドメインを骨格にもち、一部のアミノ酸残基をランダマイズしたアフィボディ・ライブラリーを用いる。本年度は、アフィボディ・ライブラリーをT7ファージ表面に発現させた。今後、このライブラリーをスクリーニングし、ユビキチンリガーゼと融合する予定である。
改変型ユビキチンリガーゼを搭載し、任意の細胞及び臓器を標的とするDDSナノキャリアとして、B型肝炎ウィルスエンベロープに由来する抗体結合型バイオナノカプセルを使用する。本年度は、Lタンパク質、Gタンパク質の抗体結合部位をもつ新規のLL-BNCとLG-BNCと既存のZZ-BNCについて比較検討を行った。それぞれのBNCに抗EGFレセプター抗体を提示させたものを作製し、EGFレセプターを高発現するA431に添加したところ、LL-BNCが他のBNCに比べて高い導入効率を示した。今後、各BNC上での抗体の配向性と細胞取り込み効率の観点から、導入効率の違いの要因を明らかにする予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

抗ヒト血清アルブミン(HSA)一本鎖抗体(Fv)とRBCK1の融合タンパク質Fv-RBCK1を発現精製したが、in vitroにおいて期待されたHSAのユビキチン化が観察されなかった。改変型ユビキチンリガーゼの基質認識部位とバイオナノカプセルによる細胞特異的DDSキャリアの開発は順調である。

今後の研究の推進方策

Fv-RBCK1については、一本鎖抗体(Fv)とユビキチンリガーゼをつなぐリンカーの長さを複数検討し、最適なリンカーの長さを検討する。
また、モデル基質としてHSA以外のタンパク質の検討も開始する。具体的には、Fv以外の基質認識部位としてパピローマウィルス由来E7タンパク質に対するアフィボディのスクリーニングを一細胞分主装置により実施し、得られたアフィボディとユビキチンリガーゼRBCK1を融合する。
培養細胞を用いたex vivo実験を行いFv-RBCK1の特異的ユビキチン化能についても検証する。

次年度使用額が生じた理由

研究分担者のライブラリー遺伝子構築の実験費用としての物品費を想定していただが、今年度は、既存のライブラリーを用いたために費用が発生しなかった。

次年度使用額の使用計画

次年度においては、ライブラリー遺伝子の構築や精製で使用する予定である。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Bio-nanocapsules displaying various immunoglobulins as an active targeting-based drug delivery system2016

    • 著者名/発表者名
      Kenji Tatematsu, Masumi Iijima, Nobuo Yoshimoto, Tadashi Nakai, Toshihide Okajima, Shun’ichi Kuroda
    • 雑誌名

      Acta Biomaterialia

      巻: 35 ページ: 238-247

    • DOI

      10.1016/j.actbio.2016.02.010

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] バイオナノカプセルを用いた抗炎症タンパク質MTI-II の生体内ピンポイント送達法の開発2015

    • 著者名/発表者名
      立松健司、岡本一起、飯嶋益巳、黒田俊一
    • 学会等名
      第67回日本生物工学会大会
    • 発表場所
      城山観光ホテル( 鹿児島県鹿児島市新照院町41-1)
    • 年月日
      2015-10-28 – 2015-10-28

URL: 

公開日: 2017-01-06  

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