CaMKI-deltaの活性調節機構と生理機能の解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K07842
• 研究機関: 香川大学
• 研究代表者: 末吉 紀行 香川大学, 農学部, 准教授 (90346635)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: CaMKIδ / CaMKIα

研究実績の概要

Ca2+/CaM-dependent protein kinase I (CaMKI) はCa2+シグナリングで重要な役割を果たすプロテインキナーゼであり、活性化ループ内のThr残基が上流のCaMKキナーゼ (CaMKK) によってリン酸化されることにより活性化する．CaMKIのC末領域を欠損させた変異体 CaMKIα(1-294) は恒常的活性型フォームとして知られているが、大腸菌発現系で取得したCaMKIα(1-294)の活性は、CaMKKによるリン酸化を受け活性化したCaMKIαの活性には遥かに及ばない．それに対して、CaMKIδのC末欠損変異体 CaMKIδ(1-299) を大腸菌で発現させた場合、CaMKKによる活性化を受けずとも、恒常的に高い活性を示すことを明らかにしている．そこで本研究では、CaMKIδ(1-299)の活性化メカニズムを明らかにするためにCaMKIα(1-294)と比較解析を行った．まず、CaMKIδ(1-299)がリン酸化によって活性化している可能性を考え、大腸菌で発現・精製したCaMKIα(1-294)とCaMKIδ(1-299)に対してλphosphataseによる脱リン酸化処理を行ったところ、SDS-PAGEにおけるCaMKIα(1-294)のバンドに変化は見られなかったが、CaMKIδ(1-299)のバンドは顕著にシフトダウンした．また、λphosphataseで脱リン酸化したCaMKIδ(1-299)を精製し、脱リン酸化していないものと活性を比較したところ、脱リン酸化処理したものでは活性が著しく低下することが明らかになった．このことから、CaMKIδ(1-299)は大腸菌内でCaMKKによるリン酸化部位を自己リン酸化している可能性が考えられたが、リン酸化部位特異的抗体を用いて解析したところ、CaMKKによるリン酸化部位はリン酸化されていないことが示された．以上の結果より、CaMKIα(1-294)は大腸菌内でのリン酸化が起こらないため活性が低いが、CaMKIδ(1-299)はCaMKKによるリン酸化部位以外の残基がリン酸化されることにより高活性型となっていることが示唆された．

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

28年度以降の研究計画では、CaMKIδの内在性基質の探索を行うこととなっていた。計画調書の通りに実験を進めた結果、骨形成に関与するとされている転写調節因子のうち２つの分子をCaMKIδがリン酸化することを突き止めた。29年度は、これらの転写調節因子のリン酸化部位の同定と、リン酸化の意義について調べる。
一方、27年度に引き続きCaMKIδの活性調節機構の解明も行った。その過程で、研究実績の概要に示した成果が得られ、一部はBiochem. Biophys. Res. Commun.誌に発表するとともに、CaMKIδ(1-299)を“リン酸化試薬”として特許出願中である。
このような状況であるため、当初の計画以上に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

基本的には今までの体制を維持し計画を進めるが、CaMKIδの活性調節機構に関しては、質量分析による自己リン酸化部位の同定と結晶構造解析を最優先とし、産総研の絹見朋也博士、千賀由佳子博士に協力を仰ぐことになっている。CaMKIδの内在性基質の探索については、上記の通り、基質候補である2種類の転写調節因子のリン酸化部位の同定と、リン酸化の意義について調べる。

次年度使用額が生じた理由

申請時には蛍光マイクロプレートリーダーを購入する予定で予算を計上していたが、減額されたため、予定通り購入すると消耗費予算を圧迫して研究の遂行に支障を来すと判断し、27年度予算の一部を消耗品費として28年度に繰り越していた。その分、28年度の消耗品予算に余裕が生まれたため、29年度に繰り越すこととした。

次年度使用額の使用計画

29年度配分予算と合わせて、主に消耗品費として有効利用する。

研究成果

• [雑誌論文] Subcellular distribution of cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) is regulated through phosphorylation by dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1S (DYRK1A). (2017)
  • 著者名/発表者名: Oi, A., Katayama, S., Hatano, N., Sugiyama, Y., Kameshita, I., Sueyoshi, N.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 482 ページ: 239-245
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.11.048.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Expression analyses of splice variants of zebrafish cyclin-dependent kinase-like 5 and its substrate, amphiphysin 1 (2016)
  • 著者名/発表者名: Katayama, S., Senga, Y., Oi, A., Miki, Y., Sugiyama, Y., Sueyoshi, N., Kameshita, I.
  • 雑誌名: Gene 巻: 583 ページ: 15-23
  • DOI: 10.1016/j.gene.2016.02.036.
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-performance CaMKI: A highly active and stable form of CaMKId produced by high-level soluble expression in E. coli (2016)
  • 著者名/発表者名: Senga, Y., Akizuki, K., Katayama, S., Shigeri, Y., Kameshita, I., Ishida, A., Sueyoshi, N.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 475 ページ: 277-282
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.05.060.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase phosphatase (CaMKP/PPM1F) interacts with neurofilament L and inhibits its filament association. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ozaki, H., Katoh, T., Nakagawa, R., Ishihara, Y., Sueyoshi, N., Kameshita, I., Taniguchi, T., Hirano, T., Yamasaki, T., Ishida, A.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 477 ページ: 820-825
  • DOI: doi: 10.1016/j.bbrc.2016.06.141.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phosphorylated TandeMBP: A unique protein substrate for protein phosphatase assay. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, Y., Yamashita, S., Uezato, Y., Senga, Y., Katayama, S., Goshima, N., Shigeri, Y., Sueyoshi, N., Kameshita, I.
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 巻: 513 ページ: 47-53
  • DOI: 10.1016/j.ab.2016.08.020.
• [学会発表] λ Phosphataseを恒常的に発現する大腸菌株BL21(DE3, pλPP)を用いた非リン酸化型プロテインキナーゼの簡便な調製法の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 秋月一駿, 山下雅史, 石田敦彦, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] Dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (DYRK1A)はCyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5)をリン酸化し、その局在を制御する (2016)
  • 著者名/発表者名: 大井愛海, 片山将一, 波多野直哉, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] 恒常的活性型CaMKIδ(1-299)とCaMKIα(1-294)の活性化メカニズムの比較解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 秋月一駿, 千賀由佳子, 亀下勇, 石田敦彦, 末吉紀行
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] Ca2+/calmodulin依存性プロテインキナーゼI (CaMKI)による金属依存性プロテインホスファターゼ1H (PPM1H)のリン酸化 (2016)
  • 著者名/発表者名: 植田早紀, 樫村明理, 小野内貴士, 成田拓人, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] 担子菌キノコCoprinopsis cinereaに存在する2種類のCalmodulin (CcCaM1とCcCaM2)について (2016)
  • 著者名/発表者名: 山田寛樹, 小林博子, 金子啓祐, 山下雅史, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 支部創立15周年記念 日本農芸化学会中四国支部第45回講演会（例会）
  • 発表場所: 香川
  • 年月日: 2016-06-11
• [学会発表] ゼブラフィッシュCa2+/CaM依存性プロテインキナーゼIγ（CaMKIγ）の機能解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 遠山拓, 千賀由佳子, 秋月一駿, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 支部創立15周年記念 日本農芸化学会中四国支部第45回講演会（例会）
  • 発表場所: 香川
  • 年月日: 2016-06-11
• [学会発表] 金属イオン依存性プロテインホスファターゼ1H (PPM1H)とそのリン酸化部位(Ser-210)を特異的に認識する抗体の作製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 成田拓人, 植田早紀, 小野内貴士, 樫村明理, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 支部創立15周年記念 日本農芸化学会中四国支部第45回講演会（例会）
  • 発表場所: 香川
  • 年月日: 2016-06-11
• [学会発表] Cyclin-dependent protein kinase-like 5 (CDKL5)の細胞内局在が変化する要因を解析するツールとしての抗体の作製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 志賀はる香, 大井愛海, 片山将一, 亀下勇, 末吉紀行
  • 学会等名: 支部創立15周年記念 日本農芸化学会中四国支部第45回講演会（例会）
  • 発表場所: 香川
  • 年月日: 2016-06-11
• [備考] 香川大学農学部 機能生化学研究室
  • URL: http://www.ag.kagawa-u.ac.jp/sueyoshi/index.html
• [産業財産権] カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素Ｉ由来ポリペプチド、リン酸化剤、および製造方法 (2016)
  • 発明者名: 秋月一駿, 片山将一, 亀下勇、末吉紀行 他3名
  • 権利者名: 秋月一駿, 片山将一, 亀下勇、末吉紀行 他3名
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2016-095770
  • 出願年月日: 2016-05-12