| 研究実績の概要 |
本研究では、慢性閉塞性肺疾患（COPD）の早期検査法の確立を最終目標として、申請者らが開発した3,4-ジヒドロキシ安息香酸（3,4-DHPAA）を用いるペプチド配列特異的な蛍光反応を応用し、COPDのバイオマーカーとして見出されたトリペプチドであるプロリン‐グリシン‐プロリン（PGP）を標的とした、生体試料中のPGPを簡便かつ迅速に定量できる技術の創製を目的としている。
平成29年度は、前年度までに確立した生体試料中のPGP定量法を踏襲し、実際に重度のCOPD患者から得られた喀痰サンプルを使用して、喀痰中PGP量の定量を試みた。操作としては、均一なホモジネートにした喀痰50uLにPBS50iLを添加して良く混合し、遠心分離した後の上清を3,4-DHPAA反応に付した。まず、予備的実験として、喀痰のみから得られた蛍光強度と、喀痰にPGP標品をスパイクして得られた蛍光強度を比較した。その結果、喀痰に大量の蛍光物質が含まれており、PGP由来の蛍光値を正確にえることが困難であった。
そこで、蛍光反応液を蛍光検出器を備えた逆相HPLCに供し、PGP蛍光体由来のピークを分離・検出することで、PGPの定量を試みた。その結果、固定相としてODSを、移動相としてアセトニトリルを用いるリニアグラジエントを、それぞれ組み合わせた一般的な手法によって、喀痰中のPGP由来の蛍光ピークを同定可能であることを見出した。得られたクロマトグラムから算出した喀痰サンプル中PGP量は0.207umol/Lであった。以前論文で紹介された、LC-MS/MS法にて測定したCOPD患者の喀痰中PGP濃度が0.2153umol/Lであったことから、本手法によって得られたPGP値は、重篤なCOPD患者の喀痰に含まれるPGP量として適当な値であると予想される。
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