| 研究課題/領域番号 |
15K07916
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
橋井 則貴 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (20425672)
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| 研究分担者 |
鈴木 琢雄 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 主任研究官 (10415466)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 質量分析 / 水素重水素交換 / 糖鎖 / 糖タンパク質 / 相互作用解析 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は，水素重水素交換／質量分析 (HDX/MS) による糖タンパク質－糖鎖複合体の相互作用解析技術を開発する一環として，ヒトアンチトロンビン (AT)，及びATを認識する合成ヘパリン構成5糖の複合体をモデルとしてHDX/MS解析を行い，ATの合成ヘパリン構成5糖結合部位（へリックスA (hA) 及び，へリックスD (hD) 領域），及びトロンビン結合部位の露出に関連したへリックスB (hB)，ストランド3A (s3A)，及び，近位ヒンジ領域における動的構造変化を明らかにするとともに，HDX/MSにより糖タンパク質－糖鎖複合体の相互作用が可能であることを実証した．本年度は，複雑な不均一性を有する糖鎖と糖タンパク質との相互作用解析へのHDX/MS解析手法の応用可能性を検証することを目的として，未分画ヘパリン及び低分子量ヘパリンをモデル糖鎖として用いて，ATとの相互作用解析を行った．
HDX/MS解析を行った結果，未分画ヘパリン及び低分子ヘパリンを添加すると，いずれも hA 及び hD 領域の重水素交換数が減少することが明らかとなり，結合領域は合成ヘパリン構成5糖と類似していることが示唆された．また，hB，s3A，及び，近位ヒンジ領域の重水素交換数には増加傾向がみられ，合成ヘパリン構成5糖と同様の動的構造変化が生じている可能性が考えられた．一方，合成ヘパリン構成5糖と比較したとき，未分画ヘパリン及び低分子量ヘパリンでは，新たに280～310番目のアミノ酸残基付近において，重水素交換数に減少傾向がみられ，さらに低分子ヘパリンより未分画ヘパリンの方が，強い減少傾向が観察された．一般に，低分子ヘパリンは未分画ヘパリンよりもトロンビン阻害活性が低いことが知られており，本研究により明らかにされた高次構造変化とトロンビン阻害活性との関連性に興味が持たれる．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は，未分画ヘパリン，及び低分子ヘパリンをモデル糖鎖として用いて，HDX/MSにより，不均一性を有する複雑な糖鎖と糖タンパク質の複合体の相互作用解析が可能であることを実証するとともに，トロンビン阻害活性との関連性が示唆されるATの高次構造変化を特定した．また，タンパク質の方向性を考慮した表面プラズモン共鳴 (SPR) 法による結合活性評価技術の最適化を行った．HDX/MS法の糖タンパク質－糖鎖複合体の相互作用解析技術としての応用可能性を確認することができたことから，当初の研究計画どおり目標を達成していると考えられるため，おおむね順調に進展していると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度は，HDX/MSによる，トロンビン存在下でのヘパリン類－AT複合体の相互作用解析，並びに，SPR法により，ヘパリン類－AT複合体の結合活性評価を行い，両解析結果を考慮して，本年度までに見出したヘパリン類によるATの動的構造変化の生化学的意義を考察にする．また，これまでに検討した電子移動解離 (ETD) 法を用いたHDX/MS法により，アミノ酸残基レベルでの相互作用解析についても検討する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H28年度に予定していた研究が順調に進み，当初予定したよりも使用額を低く抑えることができたこと，一方で，H29年度以降に予定している試料調製及び分析等に必要となることが想定された為，当該繰越金が生じた．
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| 次年度使用額の使用計画 |
H29年度は，糖タンパク質試料及び糖鎖試料の調製，並びに液体クロマトグラフィー／質量分析等の機器分析に必要な物品の購入費，成果発表旅費等として使用する予定である．
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