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2016 年度 実施状況報告書

男性不妊と肥満の原因となるRabL2-Cep19複合体の機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 15K07929
研究機関京都大学

研究代表者

加藤 洋平  京都大学, 薬学研究科, 助教 (90568172)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード繊毛 / 鞭毛 / 中心体 / 基底小体 / 低分子量GTPase / IFT複合体
研究実績の概要

RABL2はIFT複合体と相互作用することが示唆されていたが詳細は不明であった。そこで、RABL2とIFT複合体の相互作用をVIPアッセイを用いて調べたところ、GTP結合型RABL2(Q80L)がIFT74-IFT81ヘテロ二量体を介してIFT-B複合体に結合することを発見した。さらに、精子の鞭毛運動障害を持つ不妊マウスから同定されたRABL2(D73G)変異体はIFT74-IFT81二量体と相互作用できないことや、RABL2(Q80L)はCEP19とIFT74-IFT81二量体に対して相互排他的に結合することを見出した。
IFT139(IFT-A複合体のサブニット)をノックアウト(KO)したヒト網膜色素上皮(RPE1)細胞では、繊毛内の順行輸送は正常だが逆行輸送が滞るために、IFT複合体と積み荷タンパク質が繊毛の先端に蓄積する。IFT139-KO細胞におけるRABL2の局在を観察したところ、繊毛先端部での蓄積は見られず基底小体に局在したままであったことから、RABL2はIFT複合体の積み荷ではないと考えられる。
一方、GDP結合型RABL2(S35N)またはRABL2(D73G)変異体をRPE1細胞に過剰発現させると繊毛形成が抑制されることから、RABL2の活性化に伴うIFT複合体との相互作用が繊毛形成にとって重要であることが示唆された。また、RABL2を欠損したクラミドモナス変異株は鞭毛を形成できないことも見出した。
これまでの研究結果を総合すると、RABL2はCEP19と結合した状態で基底小体に局在しているが、グアニンヌクレオチド交換因子によってGTP結合型へと変換されるとCEP19から解離し、IFT74-IFT81二量体と一過的に相互作用することによって、IFT複合体の繊毛内移行を制御し繊毛/鞭毛の形成に関与すると考えられる。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度はRABL2のエフェクタータンパク質を同定することができていなかったが、今年度はRABL2のエフェクタータンパク質としてIFT74-IFT81二量体を同定することに成功した。また、CRISPR/Cas9システムに独自の改良を加えた実用的なノックアウト細胞作製法の開発にも成功した。この手法に関する論文はMol. Biol. Cell誌に発表した。ヒト培養細胞を用いた研究の一方で、クラミドモナスのRabL2変異株を同定することに成功し、モデル生物を用いた鞭毛の解析にも進展があった。ここまでの研究をまとめた論文を投稿中であったが、2017年4月にMol. Biol. Cell誌に受理された。
以上に述べたように、研究成果を複数の論文として発表できたことから、本研究課題は概ね順調に進展していると評価している。

今後の研究の推進方策

(1) 生化学的、細胞生物学的解析: 本年度までにRABL2のエフェクタータンパク質としてIFT74-IFT81二量体を同定することができた。そこで次はRABL2のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の探索を行う。RABL2のGEFを同定できた場合には、CRISPR/Cas9システムを用いてその遺伝子をノックアウトした細胞を作製し機能解析を行う。
(2) クラミドモナスを用いた解析: RABL2とIFT74-IFT81二量体の相互作用がクラミドモナスにおいても保存されているかどうかを調べる。(1)でヒトのRABL2のGEFが同定できた場合には、クラミドモナスにそのホモログがあるかどうかを検索する。ホモログがあった場合には、その遺伝子の変異株を同定し機能解析を行う。
(3) ゼブラフィッシュを用いた解析: 精子の鞭毛運動と一次繊毛異常に起因する病的肥満におけるRABL2とCEP19の役割を解明するために、CRISPR/Cas9システムを用いてこれらの遺伝子をノックアウトしたゼブラフィッシュを作製する。ノックアウトゼブラフィッシュが作製できた場合には、精子にどのような異常が生じているか、病的肥満の表現型を示すかどうかについて調べていく。

  • 研究成果

    (24件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 5件、 謝辞記載あり 4件) 学会発表 (17件) (うち国際学会 4件、 招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] VIPアッセイ:ウエスタンいらずのタンパク質間相互作用解析法2017

    • 著者名/発表者名
      加藤洋平、中山和久
    • 雑誌名

      実験医学

      巻: 35 ページ: 89-95

  • [雑誌論文] Practical method for targeted disruption of cilia-related genes by using CRISPR/Cas9-mediated, homology-independent knock-in system2017

    • 著者名/発表者名
      Katoh, Y., Michisaka, S., Nozaki, S., Funabashi, T., Hirano, T., Takei, R., Nakayama, K.
    • 雑誌名

      Molecular Biology of the Cell

      巻: 28 ページ: 898-906

    • DOI

      10.1091/mbc.E17-01-0051

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Ciliary entry of KIF17 is dependent on its binding to the IFT-B complex via IFT46-IFT56 as well as on its nuclear localization signal.2017

    • 著者名/発表者名
      Funabashi, T., Katoh, Y., Michisaka, S., Terada, M., Sugawa, M., Nakayama, K.
    • 雑誌名

      Molecular Biology of the Cell

      巻: 28 ページ: 624-633

    • DOI

      10.1091/mbc.E16-09-0648

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Intraflagellar transport-A complex mediates ciliary entry and retrograde trafficking of ciliary G protein-coupled receptors.2017

    • 著者名/発表者名
      Hirano, T., Katoh, Y., Nakayama, K.
    • 雑誌名

      Molecular Biology of the Cell

      巻: 28 ページ: 429-439

    • DOI

      10.1091/mbc.E16-11-0813

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by the Joubert syndrome proteins ARL13B and INPP5E.2017

    • 著者名/発表者名
      Nozaki, S., Katoh, Y., Terada, M., Michisaka, S., Funabashi, T., Takahashi, S., Kontani, K., Nakayama, K.
    • 雑誌名

      Journal of Cell Science

      巻: 130 ページ: 563-576

    • DOI

      10.1242/jcs.197004

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] The phospholipid flipp ase ATP9A is required for recycling pathway from endosomes to the plasma membrane.2016

    • 著者名/発表者名
      Tanaka, Y., Ono, N., Shima, T., Tanaka, G., Katoh, Y., Nakayama, K., Takatsu, H., Shin, H.-W.
    • 雑誌名

      Molecular Biology of the Cell

      巻: 27 ページ: 3883-3893

    • DOI

      10.1091/mbc.E16-08-0586

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Regulation of ciliary retrograde protein trafficking by Joubert syndrome proteins Arl13b and INPP5E.2016

    • 著者名/発表者名
      Nozaki, S., Katoh, Y., Nakayama, K.
    • 学会等名
      2016 ASCB Annual Meeting
    • 発表場所
      サンフランシスコ(アメリカ合衆国)
    • 年月日
      2016-12-03 – 2016-12-07
    • 国際学会
  • [学会発表] Differential roles of KIF17 and heterotrimeric kinesin-II interacting with the IFT-B complex in biogenesis of primary cilia.2016

    • 著者名/発表者名
      Funabashi, T., Katoh, Y., Nakayama, K.
    • 学会等名
      The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”.
    • 発表場所
      理化学研究所 多細胞システム形成研究センター(兵庫県・神戸市)
    • 年月日
      2016-11-27 – 2016-11-29
    • 国際学会
  • [学会発表] Overall architecture of the intraflagellar transport (IFT)-B complex rev ealed by a visible immunoprecipitation assay.2016

    • 著者名/発表者名
      Katoh, Y., Terada, M., Nakayama, K.
    • 学会等名
      The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”.
    • 発表場所
      理化学研究所 多細胞システム形成研究センター(兵庫県・神戸市)
    • 年月日
      2016-11-27 – 2016-11-29
    • 国際学会
  • [学会発表] Arl13b-dependant localization of INPP5E within cilia maintains ciliary r etrograde protein trafficking.2016

    • 著者名/発表者名
      Nozaki, S., Katoh, Y., Nakayama, K.
    • 学会等名
      The 28th CDB Meeting, “Cilia and Centrosomes: Current Advances and Future Directions”.
    • 発表場所
      理化学研究所 多細胞システム形成研究センター(兵庫県・神戸市)
    • 年月日
      2016-11-27 – 2016-11-29
    • 国際学会
  • [学会発表] ジュベール症候群原因遺伝子産物Arl13bによって制御される繊毛内タンパク質輸送の分子機構2016

    • 著者名/発表者名
      加藤洋平、野崎梢平、中山和久
    • 学会等名
      第89回日本生化学会大会
    • 発表場所
      仙台国際センター・東北大学川内北キャンパス(宮城県・仙台市)
    • 年月日
      2016-09-25 – 2016-09-27
    • 招待講演
  • [学会発表] キネシン2とIFT複合体の相互作用の様式の解明と繊毛形成における役割2016

    • 著者名/発表者名
      船橋輝記、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第89回日本生化学会大会
    • 発表場所
      仙台国際センター・東北大学川内北キャンパス(宮城県・仙台市)
    • 年月日
      2016-09-25 – 2016-09-27
  • [学会発表] IFT-A複合体と相互作用するC11orf74の繊毛内タンパク質輸送における役割2016

    • 著者名/発表者名
      高原万梨子、平野友章、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第89回日本生化学会大会
    • 発表場所
      仙台国際センター・東北大学川内北キャンパス(宮城県・仙台市)
    • 年月日
      2016-09-25 – 2016-09-27
  • [学会発表] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2-Cep19-FOPの機能の解析2016

    • 著者名/発表者名
      西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第15回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
    • 発表場所
      大阪大学(大阪府・吹田市)
    • 年月日
      2016-09-10 – 2016-09-11
  • [学会発表] 繊毛内タンパク質の輸送を担うIFT-A複合体の構築様式と機能の解明2016

    • 著者名/発表者名
      平野友章、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第15回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
    • 発表場所
      大阪大学(大阪府・吹田市)
    • 年月日
      2016-09-10 – 2016-09-11
  • [学会発表] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割2016

    • 著者名/発表者名
      野崎梢平、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第15回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2016
    • 発表場所
      大阪大学(大阪府・吹田市)
    • 年月日
      2016-09-10 – 2016-09-11
  • [学会発表] Trafficking Machineries within Cilia: Arc hitectures and Functions of the IFT-A and IFT-B complexes.2016

    • 著者名/発表者名
      Nakayama, K., Katoh, Y., Terada, T., Nozaki, S., Hirano, T., Funabashi, T.
    • 学会等名
      第68回日本細胞生物学会大会
    • 発表場所
      京都テルサ(京都府・京都市)
    • 年月日
      2016-06-15 – 2016-06-17
    • 招待講演
  • [学会発表] 「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」を活用した繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式の解明2016

    • 著者名/発表者名
      加藤洋平、寺田将也、中山和久
    • 学会等名
      第68回日本細胞生物学会大会
    • 発表場所
      京都テルサ(京都府・京都市)
    • 年月日
      2016-06-15 – 2016-06-17
  • [学会発表] 繊毛内のイノシトールリン脂質代謝とタンパク質の局在におけるArl13bとIFT-Bの役割2016

    • 著者名/発表者名
      野崎梢平、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第68回日本細胞生物学会大会
    • 発表場所
      京都テルサ(京都府・京都市)
    • 年月日
      2016-06-15 – 2016-06-17
  • [学会発表] KIF17とIFT複合体の相互作用様式の解明と繊毛形成における役割2016

    • 著者名/発表者名
      船橋輝記、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第68回日本細胞生物学会大会
    • 発表場所
      京都テルサ(京都府・京都市)
    • 年月日
      2016-06-15 – 2016-06-17
  • [学会発表] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Aの構築様式と機能の解明2016

    • 著者名/発表者名
      平野友章、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第68回日本細胞生物学会大会
    • 発表場所
      京都テルサ(京都府・京都市)
    • 年月日
      2016-06-15 – 2016-06-17
  • [学会発表] KIF17とIFT複合体の相互作用様式の解明と繊毛内輸送における役割2016

    • 著者名/発表者名
      船橋輝記、加藤洋平、中山和久
    • 学会等名
      第63回日本生化学会近畿支部例会
    • 発表場所
      神戸薬科大学(兵庫県・神戸市)
    • 年月日
      2016-05-21
  • [学会発表] 「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法」の開発と繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式の解明2016

    • 著者名/発表者名
      加藤洋平、寺田将也、中山和久
    • 学会等名
      第63回日本生化学会近畿支部例会
    • 発表場所
      神戸薬科大学(兵庫県・神戸市)
    • 年月日
      2016-05-21
  • [備考] 京都大学薬学研究科生体情報制御学分野

    • URL

      http://www.pharm.kyoto-u.ac.jp/physchem/

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公開日: 2018-01-16  

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