| 研究課題/領域番号 |
15K07944
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
板部 洋之 昭和大学, 薬学部, 教授 (30203079)
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| 研究分担者 |
山口 智広 昭和大学, 薬学部, 准教授 (50347530) [辞退]
小濱 孝士 昭和大学, 薬学部, 講師 (60395647)
加藤 里奈 昭和大学, 薬学部, 助教 (30392400)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 酸化LDL / 酸化リン脂質 / リゾホスファチジルコリン / 安定同位体標識 / LC-MS/MS / LCAT / リポタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
酸化低比重リポタンパク質（oxLDL）が動脈硬化症の発症要因であること、そこに含まれている酸化ホスファチジルコリン（oxPC ）が、様々な細胞を刺激する炎症惹起性分子であり、多くの疾患に関わる可能性が知られてきた。生体内でのoxPC、そしてoxLDLの挙動を明らかにするため、安定同位体標識リピドミクスの応用を計画した。Avanti社から市販されている、重水素化ジパルミトイルPC（d13-DPPC）の合成品を入手し、ハチ毒ホスホリパーゼA2処理により、重水素化リゾPC（d13-lysoPC）を調製し、HPLCで精製した。健常ヒトLDLにd13-lysoPCを添加し、標識LDLとした。この標識LDLをヒトHDLと37℃でインキュベートした後、超遠心でLDLとHDLを分離し、各脂質成分をLC-MS/MSで分子種分析した。HDL存在下では、標識LDL中のd13-lysoPCに由来する様々な分子種のジアシル型PCが生成した。ジアシル型PCの生成は反応時間依存的に増加した。また、その一部はHDL画分に回収された。この反応がHDL上のLCATの酵素による可能性を検証するため、その阻害剤であるDTNBを加えて反応させたところ、ジアシル型d13-PC の生成が抑制された。LDLの酸化変性により生じたlysoPCは、ヒト血中ではHDLのLCATにより再アシル化され未酸化型PCに変換するとともに、一部は元のLDL粒子から別の粒子に移動することが示された。リポタンパク質におけるリン脂質のリモデリング解析に、安定同位体標識脂質を用いた手法が有効であることが示され、次年度以降、より詳細に反応条件や反応産物の解析をすすめる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
安定同位体標識の作成に成功し、今後の反応の解析に必要量を準備することができた。予備的な実験結果を得て、LDL中のlysoPC分子に由来するジアシル型PCの分子種をとらえることができた。しかもこの反応がLCAT依存的であることを示唆する結果が得られた。現時点では、小数回の実験にとどまっており、また産生されたジアシル型PC分子種の解析が不十分であるので、次年度以降の課題である。
また、作成したｄ13-lysoPCの一部は、標識酸化リン脂質プローブの調製に用いることとして、現在作成作業中である。短鎖型のPCであるd13-PGPCを用いた代謝実験も今後行いたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度の第一の目標は、LDL上のd13-lysoPCから血漿中のリポタンパク質間で起こる代謝的変換とリポタンパク質粒子間移行について焦点を絞り、その具体的な反応様式、反応産物、を明らかにすることである。すでに昨年度の検討で、上記代謝反応および粒子間移行が起こることは示されてきているので、ドナーとアクセプターの粒子の比率の影響、反応時間により平衡に達するかどうか、反応産物分子種の同定、LCAT非依存性の反応がどのくらい寄与しうるかなど、詳細な解析結果を求める。
また、d13-lysoPCから、無水グルタル酸の縮合反応で、短鎖型のPCのd13標識プローブd13-PGPCを作成する。平成28年度の第二の目標は、リポタンパク質中の酸化PCの代謝がどのようにして起こるか、安定同位体プローブの動きから明らかにすることである。短鎖型PCからlysoPCへの加水分解は、PAF-アセチルヒドロラーゼ（Lp-PLA2とも呼ばれる）による反応と考えられてきたが、この酵素とLCATとの役割分担について、明確化する。PAF-アセチルヒドロラーゼの選択的阻害剤であるpefablocとLCATの阻害剤DTNBを用いた検討が有効ではないかと考えている。
実験遂行上で気を付けたいことは、添加したd13-lysoPCから派生する代謝産物は、反応系中のLDL/HDLの全脂質からすると非常に微量なので、場合によっては検出限界以下になってしまう危険性がある。有効な感度の範囲で代謝産物の測定を進めるためには、d13-lysoPC量を今以上に確保することが望ましいと考えており、昨年度の引き続き安定同位体プローブの供給にも力を入れていく。
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