癌および炎症疾患における新規ヒアルロニダーゼの機能と発現調節機構の解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K07951
• 研究機関: 名城大学
• 研究代表者: 山田 修平 名城大学, 薬学部, 教授 (70240017)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: ヒアルロニダーゼ / コンドロイチン硫酸 / ヒアルロン酸 / 癌

研究実績の概要

本研究では、ヒアルロニダーゼ（HYAL）ファミリーの1つである、新規酵素ヒアルロニダーゼ４（HYAL4）の、癌および炎症における役割を解明しようとしている。HYAL4はヒアルロン酸（HA）によく似たグリコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸（CS）に特異的に作用する酵素であり、癌の発症に関係する可能性がある。今年度は以下の研究を行った。【１】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすHYAL4の効果： HEK293細胞に、HYAL4の遺伝子を安定導入し、高発現細胞株を作成した。HYAL4を高発現している細胞株に対して、shRNAを安定導入した。mRNAの発現量を定量し、ノックダウンが起こっていることを確認した。培地中のCS量の変化も定量したが、コントロール細胞に比べ、変化は見られなかった。【２】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすCSオリゴ糖の効果：精巣型HYALを用いて市販のHA、CS-A、CS-Cを消化した。消化物をゲルろ過HPLCで分画し、四糖、六糖、八糖を大量に得た。【３】HYAL4ノックアウトマウスの作製：次年度以降の実験のために、HYAL4ノックアウトマウスの作製を継続的に行った。現在、ES細胞への導入を行っている。【４】ヒトの癌組織や炎症組織でのHYAL4の発現：様々な癌組織におけるHYAL4の発現亢進を、リアルタイムPCRで調べた。発現亢進している癌組織もあったが、同じ種類の癌組織でも発現していない場合もあり、統一した見解が得られていない。更なる解析が必要である。【５】HYAL4の機能解明の一環として、細胞内局在を免疫蛍光染色によって調べた。基質特異性に関与する可能性の高いアミノ酸に変異を導入し、基質認識のメカニズムの解明を行った。特に中枢神経系での機能解明に注目し、発生段階の異なる脳や脳の異なる部位での発現の変化について、リアルタイムRT-PCRで解析した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

【１】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすHYAL4の効果、【２】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすCSオリゴ糖の効果、【３】HYAL4ノックアウトマウスの作製、【４】ヒトの癌組織や炎症組織でのHYAL4の発現、【５】HYAL4に特異的な阻害剤の開発、の５項目を予定していた。
【１】、【２】、【４】、【５】については、ほぼ予定取り進行しているものの、【４】、【５】についてはネガティブな結果しか得られていない。【３】は少し遅れている。そのため、新たに、HYAL4の細胞内局在の解析、HYAL4の基質特異性に関与するアミノ酸の解析を介した基質認識のメカイズムの解明を行って、成果が上がっている。よって、全体としては、バランスがとれ、おおむね順調であるといえる。

今後の研究の推進方策

【１】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすHYAL4の効果、【２】培養細胞を用いた癌の悪性度に及ぼすCSオリゴ糖の効果、【３】HYAL4ノックアウトマウスの作製、【４】ヒトの癌組織や炎症組織でのHYAL4の発現、【５】HYAL4に特異的な阻害剤の開発、の５項目を予定していた。
【１】、【２】については、順調に進んでいるので、特に力を入れて進めていきたい。【３】は少し遅れているが、CRISPR/CAS9を利用したノックアウトマウスの作製も同時進行させており、なんとか最終年度中にマウスの作製と基本的な観察だけは終えたい。【４】については、癌アレイや癌組織の新しい提供元を模索する。もし、新しい試料が入手できない場合でも、【１】や【２】の実験で代用できると考えている。【５】については、共同研究者であるインド　バンガロール大学のBasappa博士からの化合物の供給がないので、他の化合物ライブラリーを利用することを検討している。また、そのために、活性測定法の簡略化も検討している。

次年度使用額が生じた理由

ほぼ予定通りに使用したが、若干の端数が発生した。

次年度使用額の使用計画

次年度の消耗品費に組み込み、使用する

研究成果

• [雑誌論文] Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase-1 (CSGalNAcT-1) deficiency results in a mild skeletal dysplasia and joint laxity. (2017)
  • 著者名/発表者名: Julia Vodopiutz, Shuji Mizumoto, Ekkehard Lausch, Antonio Rossi, Sheila Unger, Nikolaus Janocha, Rainer Seidl, Susanne Greber-Platzer, Shuhei Yamada, Thomas Muller, Bernd Jilma, Rudolf Ganger, Andrea Superti-Furga, Shiro Ikegawa, Kazuyuki Sugahara, Andreas R. Janecke.
  • 雑誌名: Human Mutation 巻: 38 ページ: 34-38
  • DOI: 10.1002/humu.23070
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Functional validation of novel compound heterozygous variants in B3GAT3 resulting in severe osteopenia and fractures: expanding the disease phenotype. (2016)
  • 著者名/発表者名: *Florian Job, *Shuji Mizumoto, Laurie Smith, Natario Couser, Ashley Brazil, Howard Saal, Melanie Patterson, Margaret I. Gibson, Sarah Soden, Neil Miller, Isabelle Thiffault, Carol Saunders, Shuhei Yamada, Katrin Hoffmann, Kazuyuki Sugahara, Emily Farrow. (*equal contribution)
  • 雑誌名: BMC Medical Genetics 巻: 17 ページ: 86
  • DOI: 10.1186/s12881-016-0344-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] マウス脳の各発達過程におけるヒアルロン酸代謝関連酵素の発現の定量的解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山田修平、三輪一貴、水本秀二
  • 学会等名: 平成28年度 新学術領域「神経糖鎖生物学」最終シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2017-03-03 – 2017-03-03
• [学会発表] 中枢神経系におけるコンドロイチン硫酸/ヒアルロン酸の分解機構に関する研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 永井冴、藤井貴夢、水本秀二、山田修平
  • 学会等名: 平成28年度 新学術領域「神経糖鎖生物学」最終シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2017-03-03 – 2017-03-03
• [学会発表] Investigation of the amino acid residues in hyaluronidases-1 and -4 responsible for their substrate recognition (2016)
  • 著者名/発表者名: Yukiko Abe, Kentaro Yamagiwa, Shuji Mizumoto, Shuhei Yamada
  • 学会等名: XXVIII International Carbohydrate Symposium
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 2016-07-19 – 2016-07-19
• [学会発表] Studies on the mechanism of degradation of chondroitin sulfate/hyaluronan in central nervous system (2016)
  • 著者名/発表者名: Shuhei Yamada, Sae Nagai, Shuji Mizumoto
  • 学会等名: XXVIII International Carbohydrate Symposium
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 2016-07-19 – 2016-07-19
• [学会発表] Quantitative analysis of the expression of hyaluronan-chondroitin sulfate-degrading enzymes in the mouse brain during development. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kazutaka Miwa, Shuji Mizumoto, Shuhei Yamada
  • 学会等名: XXVIII International Carbohydrate Symposium
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 2016-07-18 – 2016-07-18
• [学会発表] コンドロイチン硫酸を特異的に加水分解するヒアルロニダーゼ４の細胞内局在の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 三輪茜音、水本秀二、山田修平
  • 学会等名: 第62回日本薬学会東海支部総会 大会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2016-07-09 – 2016-07-09
• [学会発表] マウス脳におけるコンドロイチン硫酸とヒアルロン酸の分解活性の検出 (2016)
  • 著者名/発表者名: 石川輝、水本秀二、山田修平
  • 学会等名: 第62回日本薬学会東海支部総会 大会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 2016-07-09 – 2016-07-09
• [学会発表] ヒアルロニダーゼ1および4におけるコンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸の認識に関わるアミノ酸残基の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山田修平、安倍優貴子、山極健太郎、水本秀二
  • 学会等名: 第48回日本結合組織学会学術大会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2016-06-25 – 2016-06-25
• [学会発表] 脳・神経系におけるコンドロイチン硫酸/ヒアルロン酸分解機構に関する研究 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山田修平、永井冴、三輪一貴、水本秀二
  • 学会等名: 第48回日本結合組織学会学術大会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2016-06-24 – 2016-06-24
• [備考] 名城大学薬学部病態生化学研究室ホームページ
  • URL: http://www-yaku.meijo-u.ac.jp/Research/Laboratory/pathobio/index.html