超解像顕微鏡を用いた脂質ドメインのインフルエンザウイルスに対する機能解析

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K07957
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 阿部 充宏 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 専任研究員 (90415068)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: インフルエンザ / 脂質の非対称性 / スフィンゴミエリン / PIP2

研究実績の概要

前年度の解析により、細胞膜二重層における脂質のフリップフロップがインフルエンザウイルスの感染効率に影響を与えることがわかった。このことから、脂質ラフトを構成する脂質のフリップフロップが、インフルエンザウイルスの出芽ではなく最初の感染に関わっていることが示唆された。脂質ラフトにおいてスフィンゴ脂質が細胞膜外層に、PIP2が細胞膜内層に存在すると考えられるが、その非対称性を維持する機構はわかっていない。そこで、本年度は、脂質の非対称性の維持とウイルスの感染に関する詳しいメカニズムの解明のために、脂質ラフトの主要な構成成分であるスフィンゴミエリンの非対称性に関わる因子のスクリーニングを行った。具体的には、shRNAライブラリーを発現させたHeLa細胞において、細胞質中においてスフィンゴミエリン分解酵素を発現したときに、細胞膜外層におけるスフィンゴミエリンの量が野生株と比べて変化する変異株を得ることを試みた。一次スクリーニングでいくつかの候補が得られた後、CRISPR/Cas9で遺伝子の変異株を作製し、表現型が再現される目的の候補を絞り込んだ。脂質の解析を行った結果、メカニズムはまだわからないが、スフィンゴミエリンの細胞膜二重層における非対称性が異常になっていることがわかった。また、細胞膜内層のPIP2の局在も変化していることがわかった。それらの遺伝子をCRISPR/Cas9でノックアウトさせたMDCK細胞でインフルエンザウイルスの感染効率を測定した結果、感染率が2倍程度高まっていることが分かった。したがって、スフィンゴミエリンの非対称性がインフルエンザウイルスの感染に関わっていることがわかった。来年度は、これらの因子および変異株を用いて、詳しいメカニズムの解明を行う。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

脂質ラフトにおける脂質二重層の非対称性の維持とインフルエンザウイルスの感染に関する詳しいメカニズムの解明のための第一歩として、shRNAライブラリーを用いてスクリーニングを行った。いくつかの方法で遺伝学的なスクリーニングを試みたが、その中の1つの方法で遺伝子のスクリーニングが成功し、因子の同定ができた。また、所属長退職のため、本年度から別の研究室へ異動した。異動先の研究室では様々な自作の顕微鏡が設置されているが、インフルエンザウイルスと脂質ラフトの可視化を同時に行えるように、顕微鏡を改造し、多重染色が可能な超解像顕微鏡を構築した。

今後の研究の推進方策

今年度に同定した因子を生化学的な方法を用いて、脂質ラフトにおける脂質二重層の非対称性の維持のメカニズムを解明する。また、異動先の研究室で新たに構築した超解像顕微鏡を用いて、今回得られた変異株を解析することにより、脂質二重層の非対称性の維持のウイルスの感染における役割に関して詳細に解析する。

次年度使用額が生じた理由

前年度までの所属長が退職し所属研究室が閉室したため、研究所内の別の研究室へ異動した。当初の計画では、予算の多くをsiRNAと関連試薬の購入に充てる予定だったが、異動先の研究室にあったshRNAライブラリーを使用したため、購入しなかった。

次年度使用額の使用計画

異動先の研究室では、前研究室が所有していなかった試薬や顕微鏡を所有している一方で、前研究室が所有していた消耗品・試薬・小型機器で次年度研究の遂行に必要なものを所有していない。次年度は、その消耗品・試薬・小型機器購入に、次年度使用額を用いる。

研究成果

• [雑誌論文] Dynamics of sphingomyelin- and cholesterol-enriched lipid domains during cytokinesis (2017)
  • 著者名/発表者名: Abe M, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Methods in Cell Biology 巻: 137 ページ: 15-24
  • DOI: 10.1016/bs.mcb.2016.03.030
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Psychosine-triggered endomitosis is modulated by membrane sphingolipids through regulation of phosphoinositide 4,5-bisphosphate production at the cleavage furrow. (2016)
  • 著者名/発表者名: Watanabe H, Okahara K, Naito-Matsui Y, Abe M, Go S, Inokuchi J, Okazaki T, Kobayashi T, Kozutsumi Y, Oka S, Takematsu H
  • 雑誌名: Mol Biol Cell 巻: 27(13) ページ: 2037-2050
  • DOI: 10.1091/mbc.E15-08-0555
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phospholipase Cβ1 induces membrane tubulation and is involved in caveolae formation (2016)
  • 著者名/発表者名: Inaba T, Kishimoto T, Murate M, Tajima T, Sakai S, Abe M, Makino A, Tomishige N, Ishitsuka R, Ikeda Y, Takeoka S, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 巻: 113(28) ページ: 7834-7839
  • DOI: 10.1073/pnas.1603513113
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A novel sphingomyelin/cholesterol domain-specific probe reveals the dynamics of the membrane domains during virus release and in Niemann-Pick type C. (2016)
  • 著者名/発表者名: Makino A, Abe M, Ishitsuka R, Murate M, Kishimoto T, Sakai S, Hullin-Matsuda F, Shimada Y, Inaba T, Miyatake H, Tanaka H, Kurahashi A, Pack CG, Kasai RS, Kubo S, Schieber NL, Dohmae N, Tochio N, Hagiwara K, Sasaki Y, Aida Y, Fujimori F, Kigawa T, Nishibori K, Parton RG, Kusumi A, Sako Y, Anderluh G, Yamashita M, et al.
  • 雑誌名: FASEB J 巻: 31(4) ページ: 1301-1322
  • DOI: 10.1096/fj.201500075R
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Acute accumulation of free cholesterol induces the degradation of perilipin 2 and Rab18-dependent fusion of ER and lipid droplets in cultured human hepatocytes (2016)
  • 著者名/発表者名: Makino A, Hullin-Matsuda F, Murate M, Abe M, Tomishige N, Fukuda M, Yamashita S, Fujimoto T, Vidal H, Lagarde M, Delton I, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Mol Biol Cell 巻: 27(21) ページ: 3293-3304
  • DOI: 10.1091/mbc.E15-10-0730
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 脂質イメージングによる脂質ラフトの解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 阿部充宏
  • 学会等名: 第42回レーザ顕微鏡研究会講演会
  • 発表場所: 理化学研究所 和光事業所 （埼玉県和光市）
  • 年月日: 2016-07-07
• [備考] マイタケ由来タンパク質がインフルエンザウイルスの増殖を抑制
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2016/20160822_2/