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前年度までの解析により、細胞膜二重層における脂質ラフトのフリップフロップがインフルエンザウイルスの感染効率に影響を与えることがわかった。前年度は、脂質ラフトのフリップフロップに関わる因子を同定し、大腸菌で発現させたリコンビナントタンパク質を用いて生化学的な解析を行った。その結果、同定されたタンパク質は、PIP2と結合し、膜を変形させ、脂質ラフトのフリップフロップを促進していることが示唆された。このことから、ノックアウトした細胞では、脂質のフリップフロップが出来ないため、細胞膜内層のPIP2が増加し、動態やドメインサイズが変化していることが予想された。そこで本年度は、CRISPR/Cas9によって同定した因子をノックアウトし、細胞におけるPIP2の動態やドメインサイズの解析を行った。細胞膜内層のPIP2の動態を調べるために、細胞内でHaloタグのついたPLCdelta-PHを発現し、TIRFによる1分子イメージングによって解析を行った。コントロールの細胞でもノックアウトした細胞でも、PIP2の拡散係数はほかの脂質に比べて大きく低下していたが、両者の細胞間で顕著な差は見られなかった。また、PIP2のドメインの大きさを調べるために、細胞内でHaloタグのついたPLCdelta-PHを発現し、超解像顕微鏡STORMによって解析を行った。K-functionを求めた結果、コントロールの細胞でもノックアウトした細胞でも、PIP2のドメインの大きさは半径100~200 nmであることがわかったが、両者に顕著な違いは見られなかった。以上の結果から、インフルエンザウイルスの感染効率はPIP2の動態やドメインサイズではなく、細胞膜内層側にあるPIP2の量に依存していることが示唆された。
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