| 研究課題/領域番号 |
15K07994
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
田浦 太志 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 准教授 (00301341)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 生合成 / エゾムラサキツツジ / ダウリクロメン酸 / プレニル転移酵素 / ポリケチド合成酵素 |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度はエゾムラサキツツジのダウリクロメン酸生合成に関与するプレニル転移酵素及びポリケチド合成酵素の遺伝子クローニングを目的として各種検討を行い以下の成果を得た。
1）プレニル転移酵素の遺伝子クローニング
研究手法として当初計画したcDNA発現ライブラリーをPichia pastorisを宿主として構築し、グリフォリン酸を合成するプレニル転移酵素の発現株をスクリーニングしたが発現量が少ないためかこれを確認するに至らなかった。そこでプレニル転移酵素の候補配列をエゾムラサキツツジ若葉のESTライブラリーからスクリーニングすることとし、RdPTと称する候補配列を得た。RdPTはクラスター解析から二次代謝関連酵素に類似することを確認した。RdPTの酵素機能を解明するためcDNA全長を発現ベクターに組み込んでPichia pastorisを宿主として組換え酵素を調製した。RdPTはオルセリン酸及びファルネシル2リン酸からグリフォリン酸を合成したことから目的としたプレニル転移酵素であることが確認できた。
2）ポリケチド合成酵素の遺伝子クローニング
プレニル転移酵素と同様ESTライブラリーのスクリーニングによりRdPKSと称する候補配列を得た。本酵素は既知のPKSと60%程度の相同性しか示さずユニークな酵素機能を持つことが予想された。大腸菌で組換え酵素を発現し活性を測定した結果、本酵素は予想された生成物のオルセリン酸を微量しか合成せず、脱炭酸体のオルシノールを主生成物として生成した。また本酵素の反応液に異種植物のポリケチド環化酵素を共存させたところオルセリン酸の生産が促進されたことから、RdPKSはエゾムラサキツツジにおいて未知のポリケチド環化酵素とともにオルセリン酸の生合成に関与すると推察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度はダウリクロメン酸生合成経路のプレニル転移酵素及びポリケチド合成酵素の遺伝子を初めてクローニングすることを目的とした。当初計画した発現ライブラリーのスクリーニングにおいては目的遺伝子を得るに至らなかったものの、ESTライブラリーを用いたバイオインフォマティクス的な手法によりプレニル転移酵素及びポリケチド合成酵素の遺伝子を得ることに成功したことから、本年度はおおむね順調に成果を得ることが出来たと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究でクローン化したRdPTおよびRdPKSは新規酵素であるため、組換え酵素を用いた生化学的解析により基質特異性や反応速度などの酵素学的性質を詳細に解明する。次いで両酵素の立体構造についてX線結晶解析あるいは分子モデリングにより解明し、部位特異的変異導入により活性部位の構造機能の関連を明確にする。またRdPKSに関してはこれと共同して働くポリケチド環化酵素の必要性が示唆されたため、ポリケチド環化酵素の遺伝子クローニング及び機能解析を行い、オルセリン酸の生合成機構を明確にする。以上により先にクローン化したダウリクロメン酸合成酵素とあわせて生合成経路全体を遺伝子レベルで解明する。
次いでメチロトロフ酵母Pichia pastorisに各酵素遺伝子をセットとして導入し、発現することで抗HIV活性を始め種々の興味深い活性を有するダウリクロメン酸の生物生産を実現する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の遺伝子クローニングを中心とした研究は想定よりもスムーズに進行したため、物品費として想定した使用額に若干の残余、即ち次年度使用額が生じることとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の研究は本年度得られた新規酵素遺伝子に関して、組換え酵素の発現、精製、生化学的及び構造生物学的解析を含め広範囲な実験を行うため多様な物品の購入が必要である。このため本年度生じた次年度使用額を含めて適切な運用を行い研究成果を得る計画としている。
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