| 研究課題/領域番号 |
15K08011
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| 研究機関 | 摂南大学 |
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研究代表者 |
稲冨 由香 摂南大学, 薬学部, 助教 (00258089)
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| 研究分担者 |
荒木 良太 摂南大学, 薬学部, 助教 (90710682)
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| 研究期間 (年度) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| キーワード | DNAメチル化 / 生理活性物質 / 天然物化学 / エピジェネティクス |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、精神疾患との関連性が示唆される遺伝子であるbdnfのexon 4（bdnf4）に着目し、プロモーター領域500 bpの下流にレポーター遺伝子としてFirefly luciferaseを組み込んだpbdnf4-lucレポーターコンストラクトを作製した。現在、DNAのメチル化が転写活性に与える影響を解析するために、DNAメチル基転移酵素M.SssIとメチルドナーS-アデノシルメチオニンを用いて、作製したコンストラクトのDNAのメチル化を試みている。
また、プラスミドを細胞内にトランスフェクションするだけではヌクレオソームを形成しないため、ヌクレオソームの構造変化を介したエピジェネティックな転写制御機構を評価することは不可能であると考えられる。そこで、pbdnf4-lucレポーターコンストラクトを組み込んだ組換えレンチウイルスベクターを作製し、神経芽細胞腫由来の株化細胞であるNeuro2Aのゲノムにインテグレートすることで、ヌクレオソームを形成することができるアッセイ系を構築した。一方で、コンストラクトをゲノムに組み込むことにより、DNAメチル基転移酵素M.SssI によるDNAのメチル化が不可能となるため、代替方法として、CMVプロモーターの下流にDNAメチル基転移酵素（DNMT1あるいはDNMT3a）のcDNAを組み込んだ組換えアデノウイルスベクターを作製し、DNAメチル基転移酵素の過剰発現を試みた。現在、DNAメチル基転移酵素の過剰発現によるコンストラクトのDNAのメチル化を解析している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
精神疾患に関する遺伝子であるbdnfのDNAメチル化レベルを評価するため、人工的にメチル化した標的遺伝子プロモーターの下流にレポーター遺伝子を組み込んだルシフェラーゼアッセイの構築を進めている。同時に、今後の活性評価に使用するため、新たに植物エキスの作成や、含有成分の単離を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に引き続き、コンストラクトのDNAメチル化処置や、他の精神疾患関連遺伝子（gdnf、srd5a1、reelinなど）のプロモーターを組み込んだコンストラクトの作製を行うなど、アッセイ系の構築を試みると共に、構築したアッセイ系を用いて、所有する植物エキス、化合物ライブラリーをスクリーニングし、DNA脱メチル化活性を有する化合物を探索する。
活性がみられた植物エキスについては、カラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを用いて活性成分の単離を行う。単離化合物の化学構造は、NMR（核磁気共鳴）、MS（質量）、IR（赤外線吸収）、UV（紫外線吸収）、CD（円二色性）などのスペクトルデータの解析、必要に応じ化学反応を行い、化学的、物理学的な考察を加えて化学構造を明らかにする。また、配糖体成分から加水分解によって得られるアグリコン、化学反応による誘導化や構造変換を行って作成した含有成分のアナログも活性評価の対象としてスクリーニングをすすめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題が27年度の追加採択であり、実際に補助金が使用できるようになったのが27年12月に入ってからであったので、年度内に全てを使用して研究を遂行することが困難であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
初年度に計画していたアッセイ系の構築を引き続き行うことから、必要なベクターや多数の化合物のスクリーニングに用いる試薬が必要となる。また、実験の進行状況によっては実験動物を用いたin vivoでの評価を始める可能性もある。引き続き、試薬や実験動物の費用を中心として使用する予定である。
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