| 研究課題/領域番号 |
15K08034
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
飯島 洋 日本大学, 薬学部, 教授 (30465281)
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| 研究分担者 |
丹羽 典朗 日本大学, 薬学部, 准教授 (20541973)
齋藤 弘明 日本大学, 薬学部, 助教 (30385976)
鈴木 守 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (40280507)
小林 弘子 日本大学, 薬学部, 准教授 (50216066)
高宮 知子 日本大学, 薬学部, 助教 (50513917)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | カテコールO-メチル転位酵素 / 賦活化 / 平衡透析 / COMT |
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| 研究実績の概要 |
我々は精製過程でCOMTには二量体分子量を持つ状態に加え、システインの酸化状態に違いがある多形の混合物であることに気づき、二量体と単量体は遅い平衡にあり、精製したてでは高純度でも、二量体画分も単量体画分も数日のうちに混在物になることを見出した。近年二つのグループから報告されたドメンスワップ二量体であると考えている（Angew Chem . 2016, 55, 2683; Acta Cryst. 2014 D70, 2163)。我々の測定では二量体の比活性は単量体よりも数倍以上低いが、興味深いのは、スワップダイマーの結晶構造がapo体でも、阻害剤/S-アデノシルメチオニン/Mg複合体でも得られている点である。
二量体の問題は不可避と考えられたので、菌体から迅速に単量体を精製し（菌体破砕/アフィニティ/徹底透析（菌体からのSAH/SAMの持ち込み対策）/イオン交換/ゲル濾過/濃縮: 7日）,結晶化担当に15mg程度を供した。我々は化合物による賦活化はSAHによる生成物阻害の解除であることを明らかにしており、活性調節化合物はCOMTとの複合体を形成することを期待している。
オキサビシクロノナン系化合物には賦活化活性と阻害活性を示すものがある。この両者について、平衡透析法により、COMTとSAHの解離定数への影響を測定した。阻害物質もCOMT/SAH複合体の解離定数を大きくした(1uM→2uM以上）。このことからCOMT/化合物複合体が存在すると推定している。
上記の推定に基づいて、COMT/SAH yajirusi e/COMT/SAH → e/COMT → COMTというルートを想定した。このルートはCOMT/SAH→COMTというルートを迂回するモデルである。平衡実験と同様の条件を設定したシミュレーションを行い、迂回路モデルは今までの速度論実験の結果もうまく説明できることを示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
化合物の合成では、オキサビシクロノナン系化合物誘導体の合成を行った。一部の化合物は不安定であり、合成終了後短時間で純度が大幅に低下してしまうことがわかったが、現在までに6つの化合物の合成と活性評価が終了した。スクリーニングヒットA00013を上回る活性ではないが、二つの化合物は賦活化活性を示すと同時にA00013とA00232で見られた賦活化と阻害の構造活性相関も維持していた。高活性化合物の可能性を予感させる点で心強い。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度検討した迂回路モデルは、化合物がCOMT/SAH複合体とアポ状態のCOMTのどちらかに親和性を示すかによって、賦活化化合物と阻害化合物になることを予測している。もしそうならば、阻害剤を起点に賦活化物質を設計できる可能性がある。COMTはリガンドの結合の有無により構造変化が大きなタンパク質であり、賦活化物質や阻害物質などの活性調節物質がCOMTにどのように認識されているのかを調べるためには立体構造の解明が重要である。改良した精製法により、6 L培養で得た発現大腸菌より一週間で抽出/アフィニティクロマト/徹底透析(複合体結晶化の際にリガンド競合が起こらないように、菌体から酵素が持ち込むSAM, SAHの除去）/イオン交換クロマト/ゲル濾過/濃縮と進め15mgの精製単量体画分を用いて結晶化実験を実行中である。
オキサビシクロノナン系化合物に賦活化活性を持つ化合物が得られた。この化合物はスクリーニングヒットよりも低分子量であるので、さらに化学修飾を加えうる。また、オリジナルヒットの低分子量誘導体の合成も行い、ファーマコフォアの同定を行う予定である。また、賦活化活性に必要な構造を持つ強い阻害活性物質を合成すれば、結晶構造解析に成功する確率が上がる。立体構造上の有用な知見を引き出せる。
我々のCOMT研究の最終的な目標はvivoでCOMT賦活化がどのような効果を示すのかという点である。そのためには、vivo実験に耐えうる化合物の取得が不可欠である。28年度はratCOMTを組み換えタンパクとして取得し、現行の化合物が種の違いを越えて酵素活性の賦活化を行うかを調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定よりも旅費の支出が少なかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
28年度において、酵素精製のための物品費に充当する予定である。
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