| 研究課題/領域番号 |
15K08049
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| 研究機関 | 名城大学 |
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研究代表者 |
打矢 恵一 名城大学, 薬学部, 准教授 (70168714)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | Mycobacterium avium / 肺M. avium症 / MATR-VNTR型別解析 / pMAH135プラスミド |
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| 研究実績の概要 |
平成２７年度の研究実施計画は、Mycobacterium aviumにより引き起こされる肺疾患（肺M. avium症）の病態の予測と解明である。国立病院機構東名古屋病院に保存されている全国の国立病院機構の各病院より分与された肺M. avium症患者由来株を使用し研究を実施した結果、以下の研究成果が得られた。
１．M. avium（45株）の提供者の臨床データの解析により、悪化群と安定群の２つのグループに分類した。悪化群は肺M. avium症と診断された後、12～18か月の経過観察中に臨床所見や臨床症状の悪化が見られ治療を開始したグループ、安定群は悪化が見られなかったため治療を行わなかったグループである。これらの患者の臨床背景を調べた結果、年齢・性別・基礎疾患・肺疾患の病型などにおいて、両グループにおいて有意な違いが見られなかった。以上の結果から、肺M. avium症の悪化において、これらの宿主側の要因とは関連性が無いことが判った。
２．これらの臨床分離株を使用して、M. avium tandem repeat（MATR）15領域を用いたVNTR（variable numbers of tandem repeats）型別解析を行った。その結果、悪化群が有意に多く含まれるクラスターが形成された。以上の結果から、MATR-VNTR解析は肺M. avium症の悪化を予測できる有用な解析法であることが証明され、臨床応用できる可能性が強く示唆された。
３．我々は以前の研究において、肺M. avium症患者由来株の解析により病原性や薬剤耐性に関わる遺伝子をコードしている194,711 bpの大きさの新規プラスミド（pMAH135）の存在を報告した。それ故、pMAH135の存在は肺M. avium症の悪化に関与していることが示唆されたため、pMAH135上にコードされている遺伝子の存在を調べた結果、増悪群由来株に有意に多くその存在が見られた。以上の結果から、pMAH135と肺M. avium症の悪化との関連性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２７年度の研究目的は、M. aviumにより引き起こされる肺M. avium症の病態の予測と解明である。平成２７年度の研究実施計画に基づいて行った研究の進捗状況から、下記の理由により、当該年度における達成度については概ね達成できたと考える。
１．肺M. avium症の病態の予測については、肺M. avium症患者由来株を臨床データに基づいて、悪化群由来株（17株）と安定群由来株（28株）の２つのグループに分類しMATR-VNTR解析を行った。その結果、悪化群と安定群由来株は異なったクラスターを形成し、悪化群由来株が有意に多く存在するクラスターが形成された。この結果から、MATR-VNTR解析により病態の予測が可能となり臨床上、重要な知見を得ることができた。平成２７年度の研究計画では、MATR-VNTR解析法は感染様式が異なるHIV陽性患者由来であるM. avium 104株のゲノムに基づいていることから、我々が開発した肺M. avium症由来株のゲノムに基づいたHNTR-VNTR型別解析法を用いて解析を行う予定であった。しかし、肺M. avium症の病態の予測においてMATR-VNTR解析法の有用性が認められたことから、HNTR-VNTR型別解析法は実施しなかった。
２．肺M. avium症の病態の解明については、我々が以前に報告した肺M. avium症患者由来株由来のpMAH135プラスミドの存在について検討を行った。pMAH135上には病原性や薬剤耐性に関わる遺伝子がコードされていることから、この存在が肺M. avium症の悪化に関与している可能性が考えられた。そこで、pMAH135上の遺伝子の存在をPCR法により調べた結果、悪化群由来株に有意に多く存在し、pMAH135の存在が肺M. avium症の悪化の要因である可能性が考えられた。しかし、平成２７年度の研究計画ではpMAH135の存在をパルスフィールドゲル電気泳動法（PFGE）によって調べる予定であったが、この計画については来年度に実施する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題の今後の推進方策について、肺M. avium症患者の悪化群由来株（17株）と安定群由来株（28株）を用いて、網羅的なゲノム解析を行うことにより、肺M. avium症の悪化（重症化）に繋がる遺伝子の同定を行う。さらに、我が国で分離されるM. aviumと諸外国の分離株との比較・検討を行うことにより、我が国での増加要因の解明を行う。
１．平成２７年度において、肺M. avium症患者の悪化群由来株は、MATR-VNTR解析によって独自のクラスターを形成し、さらにpMAH135上にコードされている遺伝子を安定群由来株に比べて有意に多く保有していることが判った。そこで、平成２８年度においては、pMAH135の存在をPFGE法で調べることによって、その存在の確認を行う。また、悪化群と安定群由来株の網羅的なゲノム解析を行うことにより、両群のゲノムを詳細に比較することによって悪化群由来株に特異的に存在する遺伝子を調べる。そして、VFDB（virulence factor data base）に登録されているMycobacterium属の病原遺伝子を参考に検索を行うことにより、肺M. avium症の悪化に繋がる病原遺伝子の同定を行う。
２．我が国での肺M. avium症の増加要因の解明を行うために、web上で公開されている海外で分離・解析されたM. aviumのゲノム情報を利用して、上記で得られた国内由来株のゲノムと比較を行う。それにより、国内由来株に特異的に存在している病原遺伝子等を調べることにより、国内由来株の特徴を調べる。pMAH135の存在においても国内由来株の特徴である可能性が考えられ、pMAH135上にコードされている遺伝子群の存在を遺伝子解析ソフトを用いて調べる。もし、pMAH135の存在が国内由来株に特徴的なことであれば、我が国での増加要因の解明において非常に有用な知見となる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２７年度の研究実施計画において、以下の計画を一部変更および予定どおり実施できなかったことから、研究費の次年度への繰り越しが生じた。１．肺M. avium症患者のすべての悪化群と安定群由来株について、pMAH135の存在をPFGE法で調べる予定であった。しかし、PFGE法で巨大プラスミドであるpMAH135の存在を調べることは容易ではなかったため計画を変更し、最初にpMAH135上にコードされている特異的な遺伝子をPCR法によりスクリーニングを行った後、その保有株についてPFGE法で調べることにした。２．悪化群由来株と安定群由来株の45株について、ゲノム解析を行う予定であったが、すべての株について実施できなかった。上記の計画については、平成２８年度においても引き続き行う予定であり、繰り越した研究費を使用する予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２８年度の研究実施計画に従って研究を遂行するために、以下のように研究費を執行する予定である。平成２７年度に行った肺M. avium症患者の悪化群と安定群由来株について、pMAH135上にコードされている特異的な5遺伝子の存在を調べた結果、約40％にその存在が見られたことから、それらの菌株についてpMAH135の存在をPFGE法で調べる予定である。また、肺M. avium症患者の悪化群と安定群由来株のゲノム解析については、平成２７年度に実施できなかった残りの菌株すべてについて行う予定である。当大学にはゲノム解析に必要な次世代シーケンサーであるHiSeq（イルミナ社）を有していないため、北海道システム・サイエンス社に外注を予定している。
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