| 研究課題/領域番号 |
15K08051
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| 研究機関 | 大阪薬科大学 |
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研究代表者 |
天野 富美夫 大阪薬科大学, 薬学部, 教授 (90142132)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | VBNC状態 / サルモネラ / 乾燥耐性 / 抗体産生誘導 |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度は、VBNCサルモネラを分離してモノクローナル抗体を作成するための基礎的な条件検討を行った。従来の研究から、VBNCサルモネラは、乾燥耐性獲得の実験手法により、対数増殖期のSalmonella Enteritidis (SE)を生理食塩水に懸濁後、乾燥用のフィルター付きチューブに入れて室温で自然乾燥させることによって調製できると思われた。そのため、これと同様の条件で一晩、乾燥させてから氷冷したPBSを添加して復帰させた菌(A)と、対照として、VBNC状態にはならずほぼ元通りの増殖活性を保持する条件であるLB培地中で一晩、乾燥させて復帰させた菌(B)を調製した。次に、この2種類の菌を用いて、BALB/cマウスに感染させて免疫する条件を検討した。その結果、1回目の実験では、1群5匹のマウスに対して、菌(A)は5匹中2匹が2週間生残したのに対し、菌(B)では生残が0匹であった。2回目の実験では、菌(A)は5匹中5匹、菌(B)では0匹が生残した。しかし、これらの生残マウスの血清は、ミクロスライド凝集法を用いて検討した場合、いずれの菌に対しても凝集活性を示さなかった。以上より、乾燥から復帰させた菌を用いてマウスを生菌免疫しても、十分な力価の抗体を得ることが難しいことが示唆された。そこで、次に、菌(A)及び(B)をホルマリン固定した後、1回に1x10e6ずつ、マウスの腹腔内に週に1回、4週に亘って投与して免疫し、抗体の産生誘導の有無を調べた。その結果、菌(A)では5匹中4匹、菌(B)では5匹中2匹にそれぞれの菌を凝集させる活性を持つ抗体を誘導したことが示唆された。現在、それぞれのマウスから得られた抗体が認識するエピトープを、菌(A)及び(B)のそれぞれの菌体ならびに対数増殖期の菌体を抗原として用い、SDS-PAGE/Western blottingによって検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では、VBNC状態のサルモネラの抗原性が十分に高いと想定されたため、生理食塩水中で乾燥させてから氷冷したPBSで復帰させた菌をマウスに感染させれば、生菌免疫の条件で抗体を産生誘導できると考えていた。しかし、実際に感染させると、1回目の実験では5匹中3匹が致死となり、2回目は5匹中0匹が致死となったものの、いずれの場合も生残したマウスの血清中に、ミクロスライド凝集法（この方法は、菌体表面を認識する抗体の存在を調べるのに適した方法である）で検討した場合に抗体の存在が認められなかった。そこで、菌をホルマリン固定してからマウスの腹腔内に反復投与することによって抗体産生を誘導できるか、検討した。その結果、ホルマリン固定菌の場合には、ミクロスライド凝集法で凝集活性を持つ抗体の産生誘導が起こることが示唆された。この結論に至るまでに時間がかかったため、今後、抗原エピトープ解析とともに、モノクローナル抗体作成に向けた準備を進める。また、装置として購入したMLISAプレートリーダーを、ミクロスライド凝集法と併用することによって、VBNC状態のSEを高感度検出する条件と方法を見出すように努める。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスを用いてモノクローナル抗体を作成する場合、特定の抗原を精製・調製した後であれば、スクリーニングを含めて、比較的容易である。しかし、本研究のように、目的とする抗原が未定の場合、「VBNC菌の免疫→（ポリクローナルな）抗血清の分離と抗原に対する反応性の検討→VBNC状態のサルモネラを示す菌に特徴的な抗原エピトープの探索→抗原の同定→ 」の操作を繰り返し行いながら実験を進める進めることになる。本研究においては、このようにVBNC菌の免疫方法自体を検討しながら研究を進める必要がある。
良い抗体を産生誘導されたと思われる候補のマウスを得て、脾臓からのBリンパ球の回数とハイブリドーマの作成に進むことができるよう、実験を継続する。また、従来の研究から、VBNC菌の培養可能な状態への復帰に伴い、菌体表面に繊毛（FimA, FimHからなる）が突出してくることが観察されている。そこで、本実験と並行して、VBNC菌のマーカーとなる可能性があるFimA, FimHを組換え体として発現させ、ウサギに免疫して抗血清を得ること、及びその抗体を使用してVBNC菌の特異的な認識をすることを確認する実験も並行して進めることとする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
旅費については、年度末の3月期の出張であったため、出張に関する手続きや報告は完了しているが経理処理が間に合わなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
旅費については、経理処理を依頼して、平成28年度に支給されるように経理課に相談する。
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