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これまでの研究で、ストレス付加した1個の菌を抗体によってVBNCであると示すことはできなかった。そこで本年度は、過酸化水素の曝露によって病原性のサルモネラをVBNC状態にし、そこから増殖可能な状態への復帰することを指標に研究した。我々はピルビン酸(PA)添加が復帰率を大きく上昇させることを見出していたので、本年度は、VBNC菌に対するPAの作用機構の解明とともにVBNC菌のマーカーとなる性質を見出すことを目的にした。
実験は、病原性の環境分離株SECl#15-1をLB培地中で一晩前培養後、新鮮なLB培地中に加えて対数増殖期まで培養した。PBSで洗浄後、LB培地 に接種し、3 mM 過酸化水素を添加して37℃、60分間、酸化ストレスを与えVBNC状態の菌を調製した。氷冷PBSで洗浄後、菌をM9最少培地中に懸濁し、0.3 mM PAを添加して37℃で3時間、静置培養した。最後に菌液をPBSで適宜希釈し、LB寒天培地上に塗布して一晩培養しコロニー数(CFU)を計測して生菌数を求めた。その結果、CFUはM9培地単独ではほとんど上昇しなかったが、0.3 mM PAの添加によって数十倍から百倍、上昇した。一方、TCA回路で代謝される基質のうち、オキサロ酢酸は0.3 mM でPAと同等以上のCFUの上昇を示した。これに対し、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸はCFUを上昇させたがその効果は弱かった。これらの結果は、PAからオキサロ酢酸への代謝変化が重要であること、およびTCA回路の基質のうちオキサロ酢酸に特有の代謝がVBNCサルモネラの増殖性の復帰に関与している可能性を示唆すると思われる。以上の結果は、VBNCの定義に「再活性化して増殖性を復帰できる」ことを加えることの妥当性を示唆する。
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