| 研究実績の概要 |
本研究者らはこれまでにCd2+の輸送にZn輸送体ZIP8, ZIP14が重要な役割を果たすことを見出してきた。本研究はCd毒性の標的組織である腎臓におけるCdの輸送機構を詳細に明らかにするために、近位尿細管のS1、S2、S3それぞれの領域から作成した不死化細胞を活用し、尿細管の部位特異的な輸送機構の解明を目指した。
本年度は、S1、S2、S3細胞が近位尿細管の部位特異的な性質を保持していること、カップ培養が可能であることを確認後、管腔側、血管側それぞれからのCd2+の輸送能を調べ、ZIP8、ZIP14が特にS3領域におけるCd2+の取り込みに関与している可能性を明らかにした。Cd2+と同様にZIP8、ZIP14を介して輸送されるMn2+も同様の傾向を示した。S3細胞におけるCdとMnの蓄積量が高いことから、これらの細胞間でCdとMnに対する感受性が異なるのではないかと考え、細胞毒性をalamarBlue法を用いて比較した。Mnは蓄積量の結果と一致して、S3細胞が最も高いMn感受性を示した。しかし、Cd感受性には差がなかったので、Cd蓄積量以外の因子が毒性発現に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。今後、腎毒性の新規バイオマーカーの発現誘導を指標に、Cd2+に対する感受性を比較する予定である。
本研究者らは、Cd－メタロチオネイン複合体（Cd-MT）が尿細管上皮細胞のS1, S2領域で取り込まれた後、一部がCd2+として管腔側に排泄され、再びS3領域の上皮細胞に再吸収される、というCdの動態が起こる可能性を提唱している。そこでCd2+輸送のみならず、Cd-MTの取り込みおよび排泄効率についても検討する必要がある。そこで今年度はCd-MTの輸送実験のため、GST融合mouse MT-Iタンパク質を大腸菌系で大量精製を行った。今後、Cd-MT調製し、解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
カドミウム（Cd）の毒性標的である腎臓近位尿細管において、Cdはメタロチオネイン（MT）と結合したCd-MTの形で糸球体を通過し、近位尿細管のS1領域からエンドサイトーシスで再吸収されることが明らかにされている。これまでの本研究者らの研究から、尿細管の部位によってはCd-MTのエンドサイトーシスのみならず、亜鉛輸送体のうちのZIP8あるいはZIP14を介したCdイオンの取り込み系が関与していること、一度近位尿細管上皮細胞に取りこまれたCdの一部は管腔側へと再び排出されていることを見出している。そこで本研究者は、近位尿細管のS1領域からCd-MTの形で一度細胞内に取り込まれたCdは再び尿細管腔へと排泄され、さらに下流のS2あるいはS3領域からイオン型のCdとして再取り込みされるというモデルが存在するのではないかという仮説を立てた。尿細管の部位ごとの詳細な輸送機構の解明を目指し、マウスの近位尿細管のS1, S2, S3それぞれの領域由来の不死化細胞を入手し、カップ培養システムを使用し、今年度はまずS1, S2, S3細胞におけるCd2+の取り込み、蓄積及び排泄効率について解析した。また、Cd2+とMn2+は共通の輸送体ZIP8、ZIP14を介して尿細管細胞に取り込まれることを本研究者らは明らかにしているため、来年度以降にMnの輸送機構についても詳細に検討したい。
Cd-MTを用いた輸送およびさまざまな検討については来年度以降に実施する予定であるが、今年度はrecombinant マウスメタロチオネイン（MT）タンパク質を大腸菌で作製する系を立ち上げた。今後、Cd-MTの調製について条件検討し、Cd-MTが調製を確認後、カップ培養系に添加してS1, S2, S3細胞への取り込みおよび排泄実験を実施することで、さらに詳細な機構を解析していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
Recombinantマウスメタロチオネインタンパク質を用いて、CdとMTを結合させたCd-MTの調製を行い、以下の検討を実施していく。
１．S1, S2, S3細胞における尿細管原尿側、血管側でのCd-MT取り込み・排泄効率：S1, S2, S3細胞においてCd-MTの取り込みおよび蓄積量に差があるか、カップ培養システムを用いて、Cd-MTの原尿側および血管側からの取り込み効率、排泄効率、24時間後の蓄積量を比較する。これらの測定は、アイソトープを用いてγカウンターで測定する。また、Cd-MTとして添加したCdが一定時間後に、原尿側あるいは血管側にCd2+としてどのくらい排泄されてくるのかを、カップ培養システムでそれぞれの側の培地内のCd2+量を測定する。
２．S1, S2, S3細胞におけるCd2+の取り込みに関わる輸送体：Cd輸送体の候補であるZIP8, ZIP14, DMT1をS1, S2, S3細胞において、各輸送体のsiRNAを導入し、各輸送体を発現抑制した際のCd取り込み効率の変化を比較し、各輸送体の寄与度を細胞ごとに比較する。
３．CdによるS1, S2, S3細胞における尿細管障害の新規マーカーであるKim-1, clusterinの発現誘導：腎障害のマーカーとしては、これまで血清クレアチニンや尿中尿素窒素 (BUN) が使用されていたが、近年、より鋭敏な指標がとして、Kim-1, clusterinなどのバイオマーカーが報告されている。しかしその機序はよく分かっていない。腎障害を起こす薬物であるシスプラチンについては、培養細胞に添加した際にこれらのマーカーの誘導が報告されているが、部位特異的な検討はされていない。そこで、これらの尿細管障害のマーカーが、どの領域由来の細胞で誘導、分泌されるのか、どのくらいのCd曝露によって誘導されるのかまずmRNAレベルで検討する。各細胞にCd2+またはCd-MTを曝露して細胞を回収し、total RNAを抽出後、real-time RT-PCR法でKim-1, clusterin発現量を定量する。
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