| 研究課題/領域番号 |
15K08062
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
近藤 一成 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 部長 (40270623)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 担子菌 / 細胞死 / 急性脳症 / AIF |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、食用とされてきたスギヒラタケきのこによると考えられる食中毒死亡事例（約２０名死亡）に関連して、この菌類摂取による脳症発生原因究明や原因物質の特定に関する研究である。これまでに、この菌類摂取によるミトコンドリア機能障害が深く関係していることを示してきた。さらに、脳症とミトコンドリア機能障害に関わる分子としてAIFを特定した。一方で、AIFはミトコンドリアだけではなく核内においても重要な役割を果たしていると考えられるが、技術的に生存に必修の分子AIFの核内のみの機能を解析できる実験系がそんざいしないことからその役割は現在まで明らかではない。そこで、急性脳症の発症に関わる分子の一つと考えられたAIFのミトコンドリア機能障害に関与する分子メカニズム、およびこれまで十分検討されていないAIFの核内での生理作用実態を明らかにすることを目的に研究を行う。ミトコンドリアに局在して酸化的リン酸化に関与する一方、細胞核に移行して細胞死を誘導するという相反する機能を有する分子AIF (apoptosis-inducing factor) のミトコンドリア内および核内での役割をまずin vitroで完全に解明するために、ドナーベクターとともにゲノム編集技術を用いてラットROSA26領域に核移行できない変異体作成を相同組換えにより行った。次に、同様にドナーベクター存在下ゲノム編集を用いて、相同組換えにより内在性AIFを破壊するためにエキソン７をhygromycin耐性遺伝子置換させ、様々な刺激下においてもAIFが核に移行できない変異体としてnu-defAIF細胞株を樹立した。現在、これを用いて、AIFのミトコンドリアおよび核内での役割を後明らかにしていくところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、菌類摂取による脳症発生原因究明に関する研究である。これまでにミトコンドリア機能障害が関係していることを示してきたが、これに関与する分子AIFの機能の完全解明を目指してこれまでにミトコンドリアにのみ局在して核に移行できない変異体を作製して核内での役割を検討しようとしてきた。AIFエキソン３中の２つのロイシンをアラニンに置換するために、TALENおよび相同組換え用のドナーベクターを細胞に導入して抗生物質による選抜を行ったが、エキソン３での改変は困難であった。そこで、変異体を組換えの起きやすいROSAの領域にまず導入して、その後、内在性の野生型AIFを破壊することを試みた。このため、準備段階に多くの時間を費やしたが、目的の変異体が完成したため、今後は順調に進行可能な状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、アポトーシス性の様々な刺激下においてもミトコンドリアに局在して核移行できないAIF変異細胞株を樹立した。今後、様々な刺激物質に対する効果を核、および、ミトコンドリアで詳細に検討する。特に、近年AIFには従来考えられていた細胞死誘導能力はないか、低いとの報告が複数あることから、この点と、核内におけるゲノム安定性との関係などを明らかにする。さらに、菌類より単離した脳症原因物質の作用機構を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
関与する分子AIF機能の完全解明を目指してこれまでにミトコンドリアにのみ局在して核に移行できない変異体を作製して核内での役割を検討しようとしてきた。そこで、AIFエキソン３中の２つのロイシンをアラニンに置換するために、TALENやCRISPR/Cas9および相同組換え用のドナーベクターを細胞に導入して抗生物質による選抜を何回か行ったが、エキソン３での改変は困難を極めて実現できなかった。そこで、方針を転換して変異体を組換えの起きやすいROSAの領域にまず目的の変異体導入して、その後、内在性の野生型AIFを破壊することを試みた。このため、準備段階に多くの時間を費やしたが、目的の変異体が完成したため、今後は順調に進行可能な状況である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在アポトーシス性の様々な刺激下においてもミトコンドリアに局在して核移行できないAIF変異細胞株を樹立した。今後、様々な刺激物質に対する効果を核、および、ミトコンドリアで詳細に検討する。特に、近年AIFには従来考えられていた細胞死誘導能力はないか、低いとの報告が複数あることから、この点と、核内におけるゲノム安定性との関係などを明らかにする。さらに、菌類より単離した脳症原因物質の作用機構を解明する。
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