| 研究課題/領域番号 |
15K08082
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
井上 勝央 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (50315892)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | リソソーム / 好中球 / トランスポーター |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、刺激応答性のexocytosis機構を介したリソソームトランスポーターの細胞膜局在化、リソソームトランスポーター（様タンパク質）の遺伝子クローニングおよびリソソームを用いた薬物の迅速輸送評価システムの構築について検討を行った。ヒト白血病細胞株であるHL-60細胞をDMSO処理により好中球様細胞に分化誘導後、PMA（PKC活性化因子）とイオノマイシンで処理することで脱顆粒を惹起し、リソソームの主要な膜タンパク質であるLAMP1が細胞膜へ局在することが示された。この結果より、分化HL-60の細胞内顆粒はリソソームと類似の構造を有しており、その顆粒膜に存在するリソソームタンパク質はexocytosisにより細胞膜へ移行し得ることが示唆された。そこで、分化HL-60細胞へ発現させることを目的として、リソソーム局在が報告されている各種機未知トランスポーター（SLC46A3、Pqlc2、MFSD1、TMEM63A）やリソソーム局在化アミノ酸配列を有するトランスポーター様タンパク質群のcDNAをクローニングし、それらのGFP融合タンパク質を作成した。SLC46A3及びMFSD1については、接着細胞（HEK293）での局在がリソソームであることを確認した。今後、これらトランスポーターをHL-60細胞に導入し、安定発現細胞を作製する予定である。さらに、リソソームへの薬物集積を直接評価する手法としてゲルろ過と遠心分離によるスピンカラムクロマトグラフィーを適用し、薬物とリソソームを迅速に分離することができた。これらの研究成果により、リソソーム自体への薬物取り込み及び細胞内リソソームトランスポーターを介した薬物輸送の機能評価系を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度では、リソソームトランスポーターを評価するための条件検討と候補トランスポーター遺伝子の収集を目標としていた。これまでに、リソソーム膜の細胞膜局在化に関する解析、輸送実験系の構築、リソソームトランスポーターの遺伝子クローニングを進めてきているので、概ね順調に進んでいると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２８年度は、前年度までの研究を遺伝子クローニングも含めて進展させるとともに、リソソーム膜を介した薬物の輸送実験を推進していく。特に、リソソームへの集積性が示されている薬物について主体的に検討する。また、これら薬物の輸送に関与するトランスポーターの同定も行う。また、好中球のような顆粒細胞以外の接着細胞についてもリソソーム膜を細胞膜に局在化する条件を検討する。
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