|
ゲノム編集を行うためのガイドRNAはDNA2.0およびCRISPRdirectを利用して設計し、CRISPR-Cas9ベクターに組み込んだものを2つ（CATTGATGAAAAATACGACGTGGとGTCCCCCTAATAATGAAGAGGTT）作成した。それぞれのベクターはシークエンスで組み込まれたことを確認し、DH5コンピテントセルで増殖させ、トランスフェクション用プラスミドを作成した。これをHeLa、HEK293細胞等に説明書に従い、種々の条件でトランスフェクションさせ、Puromycinによる選別を行ったが、トランスフェクションされた細胞は得られなかった。プラスミドトランスフェクションでは改変細胞が得られなかったので、レンチウイルスベクターによる細胞株の作成を行った。SIGMA社から供給されているレンチウイルスベクターをPolybrene存在下、HeLa、HEK293に感染させ、Puromycinによる細胞選別を行った。この方法ではPuromycinによる効果的な選別が行われ、CRISPR-Cas9が組み込まれた細胞を得ることが出来た。得られた細胞の増殖速度は、未改変の細胞の約0.7倍に抑制され、染色体形成の異常により、細胞増殖が影響されていることが示唆された。また、SMC4の機能解析のため、マイクロRNA101-5pを導入実験を行った。陽性コントロールとしてsiRNAを導入すると全ての細胞でSMC4 mRNAは低下した。一方、マイクロRNA101-5pではHeLa、A549ではSMC4 mRNAの発現が抑制されたが、HEK293では約1.5倍に有意に増加したため、細胞によりマイクロRNAの機能が異なる興味ある結果も得られた。
|
