| 研究課題/領域番号 |
15K08152
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
大崎 雄樹 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00378027)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 脂肪滴 / 中性脂質 / 核内構造体 / PML |
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| 研究実績の概要 |
脂肪滴（Lipid droplet:LD）は中性脂質のコアをリン脂質一重膜が覆うオルガネラである。機能解析が進む細胞質LD (cLD)に対して、肝由来細胞などで多く存在する核内LD (nLD)の意義は未知であり、本計画ではnLDの形成機序と生理的機能の解明を目的とする。初年度の計画項目別の成果の概要は以下の通りである。
(A) nLDの形成機序の解明：細胞分裂期の異なるステージで核領域からの核膜断片の排除に関与する事が知られるSUNあるいはREEPの発現をHuh7で発現抑制すると、間期では核膜延長構造ならびにnLDが増加したが、それぞれの分子と共にPML-IIを発現抑制したところ、それらの表現型は抑制された。これらのことから肝由来細胞等では、PML-IIが細胞分裂期に核内領域に核膜断片およびnLDに結合し、おそらくクロマチンにそれらを繋留することにより核内に留め、間期での核膜延長構造とnLDの形成を促進する仕組みの存在が示唆された。
(B) nLDの転写調節・蛋白質修飾の場としての機能の検証：LD-PML小体にはユビキチン化、SUMO化、リン酸化した分子が蓄積する事が明らかとなり、同構造の蛋白質修飾への関与がさらに示唆された。
(C)nLDとウイルス増殖の関連性の検索：ウイルス蛋白質の一部はPML非依存的にnLDと直接結合し得る事が明らかになり、nLDとPMLとの結合だけでなく、ウイルス蛋白質とnLDとの結合がウイルス蛋白質とPMLとの結合に対して競合的阻害する可能性も示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画は概ね順調に推移している。項目毎の初年度の計画内容に沿って以下の事柄が明らかになった。
(A)：肝癌由来培養細胞Huh7の核内では核膜から核質に延びる膜構造（核膜延長構造）がnLDと接していた。nLDは蛋白質修飾・遺伝子発現制御の場であるPML小体と共局在した。PML小体構成分子PMLの転写variantのうちPML-IIがC末特異的配列を通じてnLDと結合し、最もnLD形成を促進した。PML-IIは内核膜 INMに結合しINM蛋白質を排除した領域(PML-II patch)を形成した。PML-IIは細胞分裂期を通じた核膜延長構造の形成に必須であった。核膜延長構造には中性脂質合成酵素が存在した。これらの結果からHuh7細胞では、PML-IIの働きにより分裂期を通じて増加した核膜延長構造から新規にnLDが形成される機構が備わることが示唆された。
(B)：分子Pは特定残基のリン酸化特異的抗体によりnLD-PML小体に限局して検出された事から、分子PはnLD-PML小体上で活性化している事が示唆された。
(C)：Ad5初期翻訳蛋白質群を一過性発現させるとE1BはPML非依存性にLDへの結合能を持っていた。一方、一過性に発現させたHCV-CoreもPMLに依存しないnLDに一部直接結合したことから、ウイルス蛋白質とnLDとの結合がウイルス蛋白質とPMLとの結合に対して競合的阻害する可能性も示唆された。
特に本計画の基盤的知見となる項目(A)を中心とした上記の成果は海外学術雑誌に掲載され高い評価を得た（Ohsaki et al., Journal of Cell Biology 212(1):29-38. 2016）。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画に従い、H28年度以降は以下の点について進行する。
(A)：核膜延長構造、nLD、PML-II、ラミナ、ヘテロクロマチン等の立体的位置関係をCLEM、連続SEM/TEM画像立体構築などにより明らかにする。核膜延長構造、nLD、クロマチンの細胞周期を通じた動態をライブ蛍光イメージングにより追跡し、PML-II発現を保持した細胞と抑制した細胞との間で比較する事により、PML-IIの膜構造・nLD増加への影響を解析する。
(B)： nLD特異的に局在する蛋白質分子、nLD-PML小体に結合するDNA配列の網羅的解析を続行する。加えて、PML-IIが核膜(PML-II patch)およびnLD表面膜に結合するための膜側のパートナー分子を、脂質・蛋白質双方の可能性を考慮し検索する。これらで得られたnLD、 PML-II結合分子について順次、GFP結合コンストラクトまたは抗体を作成し、その細胞内局在、nLD周囲での翻訳後修飾の有無などを解析する。
(C)：HCV-Core、Ad5初期翻訳蛋白質とLD、PMLとの結合比率を、核内LDの増加・減少 (脂肪酸負荷・除去培養等)あるいはLD-PML小体形成促進・阻害（PML-null Huh7細胞へのPML-II WT・C末欠損体発現）を誘導した条件下でさらに検定し、各条件でのHCV粒子形成率（HCV感染増殖モデルHuh7培養系）あるいはAd5後期転写遺伝子の発現量（レポーターアッセイ）を調べる。以上の解析を（B）で判明する予定のnLD、PML-II結合分子の発現量操作を行った細胞においても同様に実地する。
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