| 研究課題/領域番号 |
15K08154
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
藤永 竜太郎 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (30335723)
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| 研究分担者 |
篠田 晃 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40192108)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | アポトーシス / タイムラプス / プロテアソーム |
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| 研究実績の概要 |
Huntingtin-associated protein 1 (HAP1)をトランスフェクションしたマウス由来視床下部不死化細胞株を用いて、種々のストレス処理を行った(熱ショック、小胞体ストレス、酸化ストレス、プロテアソーム阻害など）。その結果、プロテアソーム阻害によりHAP1の細胞内発現形態が顕著に変化することが分かった。この現象はnon-tagged HAP1とGFP-HAP1両者に観察され、GFPタグの影響が無い事が確認されたのでGFP-HAP1を用いてタイムラプス解析を行った。通常、HAP1は細胞質内でstigmoid body （STB:封入体）を形成するが、プロテアソーム阻害剤存在下ではSTB形成ではなく、核周囲を中心に顆粒網状に発現する様子が観察された。また、プロテアソーム阻害剤存在下での細胞内オルガネラとの関係を免疫染色とタイプラプスにより詳細に解析中である。
HAP1がプロテアソーム阻害剤が誘導する細胞死にどのように影響を与えるか調べるために、その予備実験として阻害剤の濃度や処理時間を検討しカズパーゼ３の活性化を検出した。その結果、濃度、時間依存的にアポトーシスが進行することが分かった。また、他のストレス処理に関してもアポトーシスが誘導されるかどうが検討した。
Hap1ノックアウトマウスの入手が出来たため、現在、十分な数を確保するために繁殖している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
培養細胞の実験や細胞死の予備実験も当初の計画通り進行している。また、Hap1ノックアウトマウスも計画通り入手できたため、繁殖も順調である。
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| 今後の研究の推進方策 |
HAP1がストレスが誘導するアポトーシスを抑制するかどうか、western blotにより検証する。期待する効果が検出できれば、そのメカニズムを調べる。アプローチとしては、まずミトコンドリアとHAP1の関係に注目し、これらの形態学的関係、チトクロムCの放出、BaxやBcl2の発現等を調べる。
また、個体レベルではHap1ノックアウトマウスの脳切片を作成し、脳形態やアポトーシスを調べる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の細胞生物学的実験に必要な消耗品として、遺伝子導入試薬、培養デッシュ、免疫染色に必要な抗体の購入を計上していたが、研究が順調に進んだことにより予定より低額に抑えられ未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
未使用額は、平成２８年度計画に記載の細胞死解析に必要な試薬類の購入に充てる。
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