| 研究課題/領域番号 |
15K08165
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
太田 啓介 久留米大学, 医学部, 准教授 (00258401)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / CLEM / 光電子相関観察 / 3次元解析 / FIB-SEM |
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| 研究実績の概要 |
本課題は生体エネルギーの根源とも言えるミトコンドリアの品質管理に関わる形態学的背景を新しい技術を用いて動的且つ電子顕微鏡レベルで解明することによりミトコンドリアダイナミクスを新しい次元で理解することを目的としている。申請者は時空間的に特異的な現象を電子顕微鏡レベル且つ、3次元的に明らかにすることで一つの答えが得られると考え。光学顕微鏡的Live-ImagingとFIB-SEMを用いた次世代3次元構造解析（高分解能FIB-SEMトモグラフィー）を組み合わせた新しい技術を開発し、ミトコンドリアダイナミクスの可視化を進める。平成27年度は以下の3点に注力し、ほぼ目的を達することができた。
１．3次元光-電子相関観察法（3D-CLEM)の確立：光学顕微鏡で観察した領域を電子顕微鏡で正確に且つ3次元的に詳細に可視化する技術確立を目指し、その目的を達成した。GFPもしくはRFPでラベルしたミトコンドリアをLiveでモニターし、特定の現象を得たときに固定、同サンプルを電子顕微鏡用サンプルにする。この時、如何に同じ標的を見つけるのかが鍵であったが、培養基材を安定して除去する技術を確立し3D-CLEM技術を確立した。
２．ミトコンドリア分裂予定域の可視化：Drp1、MffにGFP, ｍCherry等の蛍光タンパクを融合した遺伝子コンストラクトを作成し、ミトコンドリア分裂予定域を確認し、計画を先んじてCLEM観察も成功した。
３．ミトコンドリア分裂関連蛋白の3次元的局在解析の為のツール作成
電子顕微鏡で可視化できるマーカー遺伝子としてAPEX2を用いた遺伝子コンストラクトを作成し、電子顕微鏡下でタンパク質の局在を可視化できることを確かめた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
概ね順調ではあるが、当初所定よりStable株の確立が遅れている。これは、3D-CLEMが技術的に確立したことで、その検証と応用にエフォートを集中したためである。しかし、そのおかげで、平成28年度予定の基礎部分が今年度中に進行しているため、次年度、細胞系を重点的に進めることが可能であり、この遅れは挽回することができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
３D-CLEMについて技術的な問題はほぼクリアできている。そこで、①今年度はFis1, Mff, Mfn1, Mfn2, Drp1等ミトコンドリア分裂に関わる遺伝子に光顕的・電顕的レポーター遺伝子を組み込んだ遺伝子発現をするほ乳類細胞を作成しStable株の樹立とこれらの遺伝子発現に伴う影響の確認を行う。その上で、②３D-CLEMを用いた電子顕微鏡レベルでの解析を進める。既に Drp1については解析がスタートしており、n数の確保等ルーチン的な解析を進める。また、役剤等によるミトコンドリアの動的変化を理解するため、③脱共役剤等を用いたミトコンドリアの急激な変化に伴うMAMや核様体の挙動を追跡する。一方、技術的な点では、④電子顕微鏡的レポーター遺伝子APEXは、その酵素活性をDAB発色を用いて可視化しているため、十分な分解能を得られない可能性が残る。より詳細な局在を解析するには、DAB以上の捕捉力のある基質、反応系を用いる事が望ましい。そこで、いかなる基質が望ましいのかの検討を上記3点と同時進行で行う。
以上を進めることにより、2年目の計画を当初計画と同等に遂行することができ、ミトコンドリア分裂に伴う、MAMと核様体の挙動について、時空間的に得意な現象を捉えつつ、その形態学的背景を電子顕微鏡レベルで且つ3次元的に明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ステーブル株作成に関わる点が遅延したため、培養に関わる消耗品に関する使用が遅れた
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度、ステーブル株樹立を進めるため、次年度使用学を充当する。
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