細胞膜脂質二重層の内層で見られる脂質集合体の挙動と相関についての電子顕微鏡解析

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K08167
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 村手 源英 国立研究開発法人理化学研究所, 小林脂質生物学研究室, 研究員 (30311369)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 細胞膜 / 脂質二重層 / スフィンゴミエリン / 非対称分布 / 免疫電子顕微鏡法 / 培養細胞

研究実績の概要

細胞を周囲から区切る境界である細胞膜は、数多くの脂質種が一層に並び、それら2つがお互いに向き合ってできた脂質二重層にタンパク質を含んだ構造をしている。脂質二重層に注目した場合、外界に向いた面を持つ外層と細胞内に向いた面を持つ内層では構成する脂質の種類が異なっていることが知られている。この非対称分布は、外層の脂質は電気的に中性であり細胞外にある物質との不用意な相互作用を避けなければならない一方で、内層の脂質は細胞内にある様々な物質との相互作用を必要に応じて行なう必要があるといった、細胞膜の機能そのものに重要な役割を果たしていると考えられている。ところが、ほとんどの細胞で外層と内層における脂質分布の非対称の程度は、曖昧なままである。その理由は、細胞内小器官の膜から細胞膜だけを単離することが困難なだけでなく、二重層の各層を区別することがきわめて難しいためである。
そこで本研究では、免疫電子顕微鏡法を用いて細胞膜を構成する主要な脂質の分布を明らかにすること、およびそれらの相互関係についての解析に挑むことで、細胞膜の機能における脂質の役割を明らかにする事を目的としている。本年度は、新たに開発されたスフィンゴミエリンに結合するプローブを用いて、培養細胞の細胞膜におけるスフィンゴミエリンの分布について解析を行った。その結果、細胞の状態や極性の違いによって細胞膜を構成する脂質分子の2次元的な分布を変化させていることが示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

培養細胞の細胞膜におけるスフィンゴミエリンの分布を、SDS処理凍結割断法やrip-off免疫電子顕微鏡法を用いて解析した。その結果、上皮構造を形成させたMDCK細胞のアピカル膜とバソラテラル膜や、A型ニーマンピック病の患者に由来する細胞とそのコントロールとしてのノーマルの細胞の細胞膜では、スフィンゴミエリンの分布状態が異なっていることが明らかとなった。これらのことから、細胞の分化状態や極性の違いに応じて細胞膜を構成する脂質分子種の分布に変化が起こっていることが明らかとなった。

今後の研究の推進方策

細胞膜に局在する脂質分子の分布に影響を及ぼすと推測されるタンパク質の発現を抑制させた細胞を用いて、細胞膜脂質二重層の各層における脂質分子の分布を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

論文を投稿した際に支払うことを計画していた投稿料が不要であったこと、すでに購入済であった試薬や器具を使用して実験ができたことによる。

次年度使用額の使用計画

細胞培養用や免疫電顕用の試薬、プラスチック製品やガラス製品の購入にあてる計画をしている。

研究成果

• [雑誌論文] Revisiting transbilayer distribution of lipids in the plasma membrane. (2016)
  • 著者名/発表者名: Murate M,, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Chem. Phys. Lipids 巻: 194 ページ: 58-71
  • DOI: 10.1016/j.chemphyslip.2015.08.009
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Visualization of the heterogeneous membrane distribution of sphingomyelin. (2015)
  • 著者名/発表者名: Makino A., Abe M., Murate M., Inaba T., Yilmaz N., Hullin-Matsuda F., Kishimoto T., Schieber N. L., Taguchi T., Arai H., Anderluh G., Parton R. G., Kobayashi T.
  • 雑誌名: FASEB J. 巻: 29 ページ: 477-493
  • DOI: 10.1096/fj.13-247585
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Transbilayer distribution of lipids at nano scale. (2015)
  • 著者名/発表者名: Murate M., Abe M., Kasahara K., Iwabuchi K., Umeda M., Kobayashi T.
  • 雑誌名: J. Cell Sci. 巻: 128 ページ: 1627-1638
  • DOI: 10.1242/jcs.163105
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Evaluation of aegerolysins as novel tools to detect and visualize ceramide phosphoethanolamine, a major sphingolipid in invertebrates. (2015)
  • 著者名/発表者名: Bhat H. B., Ishitsuka R., Inaba T., Murate M., Abe M., Makino A., Kohyama-Koganeya A., Nagao K., Kurahashi A., Kishimoto T., Tahara M., Yamano A., Nagamune K., Hirabayashi Y., Jyuni N., Umeda M., Fujimori F., Nishibori K., Yamaji-Hasegawa A., Greimel P., Kobayashi T.
  • 雑誌名: FASEB J. 巻: 29 ページ: 3920-3934
  • DOI: 10.1096/fj.15-272112
  • 査読あり
• [雑誌論文] CARTS biogenesis requires VAP-lipid transfer protein complexes functioning at the endoplasmic reticulum-Golgi interface. (2015)
  • 著者名/発表者名: Wakana Y., Kotake R., Oyama N., Murate M., Kobayashi T., Arasaki K., Inoue H., Tagaya M.
  • 雑誌名: Mol. Biol Cell 巻: 26 ページ: 4686-4699
  • DOI: 10.1091/mbc.E15-08-0599
  • 査読あり
• [学会発表] 細胞膜の脂質二重層を構成する各種の脂質が示す非対称分布とその破綻 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村手源英, 阿部充宏, 笠原浩二, 岩渕和久, 梅田真郷, 小林俊秀
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] Transbilayer lipid distribution in the plasma membrane at nano scale. (2015)
  • 著者名/発表者名: Murate M., Abe M., Kasahara K., Iwabuchi K., Umeda M., Kobayashi T.
  • 学会等名: 第11回GERLI Lipidomics Meeting
  • 発表場所: ビショフスハイム、フランス
  • 年月日: 2015-10-25 – 2015-10-28
  • 国際学会
• [学会発表] 細胞膜の脂質二重層を構成する様々な脂質が示す非対称分布の電子顕微鏡レベルでの解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村手源英, 阿部充宏, 笠原浩二, 岩渕和久, 梅田真郷, 小林俊秀
  • 学会等名: 第67回日本細胞生物学会年会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • 年月日: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [学会発表] Transbilayer and lateral distribution of lipids in the plasma membrane at nano scale. (2015)
  • 著者名/発表者名: Murate M., Abe M., Kasahara K., Iwabuchi K., Umeda M., Kobayashi T.
  • 学会等名: 第10回スフィンゴテラピィ研究会
  • 発表場所: ホテルアローレ（石川県加賀市）
  • 年月日: 2015-06-16 – 2015-06-18
• [学会発表] 細胞膜の内外層における構成脂質のナノメートルレベルでの局在解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 村手源英, 阿部充宏, 岩渕和久, 梅田真郷, 小林俊秀
  • 学会等名: 第57回日本脂質生化学会年会
  • 発表場所: 一橋大学一橋講堂（東京都千代田区）
  • 年月日: 2015-05-28 – 2015-05-29
• [備考] 理化学研究所 脂質の統合的理解
  • URL: http://lipidology.riken.jp/index.html