| 研究課題/領域番号 |
15K08168
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
仁田 亮 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 上級研究員 (40345038)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | CRMP2 / 微小管 / 微小管ダイナミクス / 軸索誘導 / X線小角散乱 / X線結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、微小管結合タンパク質CRMP2の微小管ダイナミクス制御の分子機構を解明し、さらにその制御機構によって神経細胞軸索伸長がどのように誘導されるのかについて、原子レベルから細胞レベルに至る多階層構造・機能解析法を用いて明らかにすることを目的とする。これに関して以下の進捗があり、論文投稿中である。
1) CRMP2は、tubulinヘテロ二量体およびその重合体である微小管と結合する際、それぞれ異なる結合面を利用する。2) CRMP2は、tubulinヘテロ二量体に直接作用して、軸索に有意に多く存在するGTP型微小管を効率よく誘導する。微小管の重合誘導時、CRMP2は微小管側面には結合せず、tubulinヘテロ二量体と一過性の複合体を形成する。3) CRMP2は通常ホモ四量体を呈しているが、tubulinヘテロ二量体と複合体を形成する際は四量体を解体し、CRMP2-tubulinのヘテロ三量体を形成する。4) CRMP2の結晶構造を解明し、さらにCRMP2-tubulin複合体の溶液構造をX線小角散乱により明らかにした。これにより、CRMP2はH19ヘリックスを主要な結合部位として利用し、tubulinヘテロ二量体のプラス端面に結合することが明らかとなった。5) 立体構造により同定した結合面のアミノ酸点変異を、ニワトリ脊髄後根神経節ニューロンおよび線虫神経系に導入した。前者においては、点変異体の過剰発現により神経細胞軸索伸長が抑制され、後者では軸索特異的な微小管誘導が抑制された。
本実験結果により、CRMP2はtubulinとヘテロ三量体を形成して軸索型微小管の誘導を促進することを通して、軸索伸張のみならず、軸索特異性の付与をも行っていることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成27年度の研究計画はほぼ完了し、平成28年度の２種の研究計画のうち、X線小角散乱によるCRMP2-tubulin複合体の溶液構造解析を遂行することができた。さらにX線結晶構造解析の構造を併用することで、CRMP2-tubulinの結合領域を高い精度で同定することができ、CRMP2結合面の変異体導入の実験に効率よくつなげることが可能となった。
CRMP2結合面の変異体を線虫やニワトリ神経細胞に導入する実験では、軸索微小管の伸長抑制のみならず、軸索微小管としての特徴の付与を阻害するという想定以上の表現型が得られ、CRMP2は微小管との相互作用を通じて、軸索伸長のみならず軸索としてのidentyを与えるために重要な働きをすることを明確に示すことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定通り、平成28年度のもう一つの計画であるCRMP誘導GTP型微小管のクライオ電子顕微鏡構造解析を進める。
また、申請の内容からさらに先に進めて、CRMP2リン酸化の意義を構造生物学的アプローチを中心として明らかにする。つまり、CRMP2がリン酸化を受けることによって、CRMP2の軸索微小管に対する作用がどのように変化するのかについて、これまでと同様の多階層構造・機能解析により解明する。CRMP2リン酸化はアルツハイマー病やパーキンソン病の発症や病状の進展にも関わることが報告されており、高分解能構造解析による創薬への進展も視野に入れる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請当初は、クライオ電子顕微鏡構造解析の試料調整目的に初年度に微量高速冷却遠心機を購入する予定であったが、昨年度はX線小角散乱やX線結晶解析、細胞生物学的解析を主体的に行ったため、遠心機の購入を見送った。また、同じ理由で電子顕微鏡実験にかかる消耗品費も当初の予定より少額であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年は、クライオ電子顕微鏡構造解析を中心として実験を進める予定であり、2年目に予定していた消耗品費や旅費、論文掲載料に加え、当初1年目に予定していた微量高速冷却遠心機や電験関連消耗品による支出を見込んでいる。
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