| 研究課題/領域番号 |
15K08196
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
尾家 慶彦 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (50396470)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 呼吸中枢 / preBotzinger complex / 自発的同期活動 / 神経ネットワーク / 二光子顕微鏡 / カルシウムイメージング / 抑制性ニューロン |
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| 研究実績の概要 |
呼吸中枢の一つであるpreBotzinger complex（preBotC）に存在する呼吸細胞（呼吸リズムに関連する細胞）の自発的同期活動生成に必要な神経ネットワーク構造に迫るため、呼吸細胞のうち抑制性ニューロンの「自発的同期活動中における活性化のタイミング」ならびに「機能阻害が細胞活性化順序の秩序に及ぼす影響」について調査を行った。
GlyT2陽性であるグリシン抑制性ニューロンでEGFP, GAD65陽性のGABA抑制性ニューロンでtdTomatoをそれぞれ特異的に発現する遺伝子組換えマウスのpreBotCを含むスライス（呼吸スライス）において、吸息性活動のタイミングを局所細胞外電位（LFP）の結果から決定し、各細胞の活動の記録をOregon Green BAPTA1の蛍光強度変化を基にしたカルシウムイメージングで行い、細胞種の同定は前記蛍光タンパク質の発現の有無で行った。カルシウムイメージングは二光子顕微鏡で行い、抑制性ニューロンの機能阻害は、薬理阻害とレーザーアブレーション法による細胞焼却除去を2つの方法を検討した。レーザーアブレーション法では、コントロール実験として抑制性呼吸ニューロン以外の種類の細胞を除去した場合にも、LFPで記録した自発的同期活動頻度の上昇が見られると言う予想外の結果が得られた。この現象が、レーザーアブレーション法の処理によるアーチファクトか否かの検討も含めて、抑制性呼吸ニューロンの活性化の順序等について現在解析を行っている。
実験にはP3-P10の遺伝子組み換えマウスを用いたが、副次的な結果として、この発育期間における抑制性呼吸ニューロンのプロファイル変化についての結果を得たため、2016年3月に開催された第93回日本生理学会大会にて発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
レーザーアブレーション法による細胞除去処理の際に予想外の結果が得られ、結果検討のために追加実験が必要となったため進展が若干遅れている。場合によっては、焼却除去の際の条件についての再検討や実験の追加が必要となる可能性もあるが、これらは次年度以降の研究予定内容の課題と重複しており、また本研究の今後に対して新たな方向性と展開をもたらす可能性があり、全体計画の伸展のために本質的に必要不可欠な検討内容であることから、全体計画の大きな遅れにはつながらないと考えている。
さらに、従来使用していた二光子顕微鏡システムから変更があったため、結果解析のプログラムの修正などに時間を要し、結果の解析にも若干の遅れが見られる。プログラムの修正後は、迅速に進展すると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は現在解析中の、「自発的同期活動中の細胞活性化順序において抑制性呼吸ニューロンが占める順番」についてまずは明らかにする。続いて、抑制性呼吸ニューロンの機能阻害時の、呼吸細胞のプロファイル変化・活性化順序等を解析し、preBotCにおける自発的同期活動生成に必要な機能的ネットワーク構造に対して抑制性呼吸ニューロンが果たしている役割について検討する。その後、検討対象とする細胞種を研究計画書に記載している順序で進めていく方針である。
また、脳幹部位の構造に対応したレーザーアブレーション法の条件の検討も必要に応じて行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
レーザーアブレーション法による細胞除去処理の際に予想外の結果が得られ、実験条件ならびに結果検討のために追加実験が必要となったため進展が若干遅れた。そのため、新規に必要な実験試薬・機器の購入を次年度以降に延長したことが次年度使用額が生じた一因である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
レーザーアブレーション法を始めとした呼吸細胞の機能阻害実験の実験条件の検討や追加は次年度以降の研究予定内容の課題と重複しており、次年度以降の研究を加速させるために必要な内容である。次年度以降は、当初の予定通りに研究が進展すると考えており、予定通りに使用する予定である。
また、国際学会への参加・発表も行う予定であり、旅費の支出も増加すると想定している。
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