| 研究課題/領域番号 |
15K08274
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
永森 收志 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90467572)
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| 研究分担者 |
大垣 隆一 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20467525)
奥田 傑 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (50511846)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 膜輸送複合体 / プロテオミクス / トランスポーター / 腎臓 / 糖 / アミノ酸 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者は、多数の腎近位尿細管管腔側膜輸送体と共に発現変動する遺伝子を、バイオインフォマティクスによって見出した。 その遺伝子がコードするタンパク質TRAPは、腎特異的に発現する新規膜タンパク質であり、近位尿細管管腔側膜 に局在した。TRAPノックアウトマウスは、糖・アミノ酸・尿酸などの尿中排泄が顕著に上昇するファンコニー（Fanconi）症候群類似のフェノタイプを示し、さらにそれらを輸送可能な複数の輸送体の局在が変化していた。そこでTRAPが管腔側膜輸送体の局在を統合的に制御する分子であると想定し研究を進めたところ、TRAPが様々な輸送体と複合体を形成していることを見いだした。それに基づいてTRAPと相互作用する管腔側膜輸送体群の全体像と、それら輸送体の局在をTRAPが制御する機構を解析した。網羅的定量プロテオミクスによりTRAPの欠失により発現量の影響を受ける輸送体を明らかにし、免疫染色によりTRAPが輸送体の局在を規定することを示した。さらに、TRAPが結合する一群の管腔側膜輸送体を明らかにし、定量的に解析した。またTRAPノックアウトマウスのフェノタイプに性差があることが分かったため、これまでオスを用いて研究を進めてきたが、メスについても研究対象にし、解析を進めている。加えて、TRAPノックアウトマウスでは細胞増殖因子GFxの著しい変動が起こることを明らかにしたことから、細胞増殖因子GFxの制御機構とTRAPの関連の解明を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
網羅的比較定量プロテオミクスによるTRAPノックアウトマウス尿細管輸送体の変動解析をおこない、TRAPノックアウトマウスの管腔側膜上での各輸送体の存在量を野生型マウスと比較することにより、TRAPの役割についての重要な情報を得た。変化が見いだされた輸送体のうち、いくつかについては、Western blotでその変化を確認するとともに、免疫染色を行い輸送体タンパク質の局在の変動を検討した。さらに高空間分解顕微鏡SIM (Structured illumination microscopy)を用いることで、TRAPノックアウトマウスにおいて、局在の変化を示す輸送体の一部について、より正確な輸送体の局在位置の変化を把握することに成功した。さらに、尿細管管腔側膜画分膜小胞を調整し、複数の化合物の輸送機能を、RI標識した基質を用いて測定し、TRAPノックアウトマウスにおける輸送体の発現量変動と機能変化について、定量的な解析を進めた。 加えて、 管腔側膜輸送体の機能を維持するTRAPの役割を明らかにするために、抗TRAP抗体を用いた免疫沈降を行い、免疫沈降物を定量型質量分析計で解析し、輸送体との複合体形成の有無を検討し、TRAPと結合している管腔側膜輸送体を定量的に解析した。またTRAPノックアウトマウスが示すフェノタイプに、性差があることが示された。これまでオスを用いて研究を進めてきたが、メスについても研究対象にし解析を進めた。加えて、TRAPノックアウトマウスでは細胞増殖因子Xの著しい変動が起こることが見いだされた。細胞増殖因子Xの制御機構とTRAPの関連の解明を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの詳細な検討から、近位尿細管管腔側膜輸送体のうち、TRAPと連携するものが明らかになっている。それぞれの輸送体がTRAPと直接結合しているのか、他の因子を介しているのか明らかにする。また、TRAP機能の性差や細胞増殖因子との関連など想定外の発見があったため、当初の研究計画にこれらの解析を加える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の研究の進展により、性差及び週齢を考慮した解析が必要になった。しかしながら、実験動物の準備に時間がかかったため、必要経費の一部を次年度に繰り越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
対象とする実験動物の準備が整い次第、性差及び週齢を考慮した解析を行う。解析の内容は、網羅的定量プロテオミクス及びメタボロミクスに加え、様々な生化学的解析を主に行う。
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