| 研究課題/領域番号 |
15K08284
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
杉本 博之 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
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| 研究分担者 |
安戸 博美 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
青山 智英子 獨協医科大学, 医学部, 助教 (90420778)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | コレステロール25-ヒドロキシラーゼ / 25-ヒドロキシコレステロール / オキシステロール / HMG-CoAレダクターゼ / シチジリルトランスフェラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
細胞内のオキシステロールを主に産生する酵素はコレステロール25-ヒドロキシラーゼ(CH25H)であり、コレステロールの水酸化を行い、コレステロールから生理活性を有する25-ヒドロキシコレステロールを産生する。最近の研究から申請者はFBS中に細胞レベルでCH25Hの転写を抑制する因子が存在することをはじめて見いだした。生成物阻害を考慮しオキシステロールをNIH3T3細胞に添加したが、CH25Hの転写レベルに変化はなかった。このことは、細胞膜脂質の産生を行う酵素HMG-CoAレダクターゼ(HMGCR)(コレステロール合成の律速酵素)やCTP:ホスホエタノールアミン・シチジリルトランスフェラーゼ(ET)(ホスファチジルエタノールアミン合成の律速酵素)の転写がFBS中のオキシステロールにより抑制される機構と、CH25Hの転写がFBSにより抑制される機構は大きく異なることを示す。そこで、FBS由来の精製分画をNIH3T3細胞に添加し、CH25HのmRNA量をRT-PCRにより測定することでFBSに由来するCH25H転写抑制因子の精製を試みた。その結果、本抑制因子はBligh-Dyer法の水溶性画分に存在し、オキシステロールのような脂質分子ではないことが強く示唆された。この水溶性抑制因子の分子レベルでの同定を試みるため、FBSをBligh-Dyer法で分画した水溶性画分を逆相C18HPLCにより分画することで、本因子の精製を試みた。その結果、CH25H転写抑制因子は逆相C18カラムに結合しアセトニトリルにより溶出する分子であることが明らかになった。現在本因子の分子レベルでの同定を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
FBS中に細胞レベルでCH25Hの転写を抑制する因子が存在し、Bligh-Dyer法で分画した水溶性画分に存在することをはじめて見いだした。そこでFBSをBligh-Dyer法で分画した水溶性画分を逆相C18HPLCにより分画することで、本因子の精製を試みた。その結果、CH25H転写抑制因子は逆相C18カラムに結合しアセトニトリルにより溶出する分子であルことが明らかになった。この抑制因子の分子量フィルター解析や、protease Kおよびglycopeptidase Fの処理により失活することから糖タンパク質ではないかと推測している。今後推測分子に即したカラムによりさらに精製を進め、本分画を本大学で保有するTriple-TOF/MS (Sciex 6600)、LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により解析することでその分子を同定する。分子の同定が困難な場合には候補になる可能性のある糖タンパク質を高発現させ、この高発現タンパク質を細胞に添加することで同定を試みる。本分子の同定は間近と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
この抑制因子の分子量フィルター解析や、protease Kおよびglycopeptidase Fの処理により失活することから糖タンパク質ではないかと推測している。今後推測分子に即したカラムによりさらに精製を進め、本分画を本大学で保有するTriple-TOF/MS (Sciex 6600)、LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により解析することでその分子を同定する。さらに今後は、本因子を細胞に添加する事でどのようなシグナル伝達によりCH25Hの転写抑制が行われるのか解析する。LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により細部内内因性各種オキシステロールを同定し、その絶対量や抑制因子によるオキシステロール量の変化を解析し、生理的状況での細胞内シグナル伝達への関与を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
この抑制因子の分子量フィルター解析や、protease Kおよびglycopeptidase Fの処理により失活することから糖タンパク質ではないかと推測している。現在推測分子に即したカラムによりさらに精製を進め、本分画を本大学で保有するTriple-TOF/MS (Sciex 6600)、LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により解析することでその分子の同定を試みているところで、候補となる因子はいくつか見出したが同定には至っていないため、更なる研究が必要である。また今後は、本因子を細胞に添加する事でどのようなシグナル伝達によりCH25Hの転写抑制が行われるのか解析する予定である。LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により細部内内因性各種オキシステロールを同定し、その絶対量や抑制因子によるオキシステロール量の変化を解析し、生理的状況での細胞内シグナル伝達への関与を明らかにする。
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