| 研究課題/領域番号 |
15K08289
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| 研究機関 | 京都産業大学 |
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研究代表者 |
津下 英明 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (40299342)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | C3 / ADPリボシル化 / RhoA / Cdc42 / Rac1 / X線結晶構造解析 / 複合体 / 構造酵素学 |
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| 研究実績の概要 |
セレウス菌由来のRhoA特異的ADPリボシル化毒素C3（C3cer)とその基質タンパクRhoAの複合体結晶を作成し、結晶構造解析を進めた。C3-RhoA(GTP)結晶を用いて、この構造を決定、次にこの結晶にNADH(不活性な補酵素）をソーキングすることで、NADH-C3-RhoA(GTP)の構造を決定した。同様にC3-RhoA(GDP)の結晶を作り、これにNADHをソーキングすることで、NADH-C3-RhoA(GDP)の構造を解析した。C3ではNAD結合部位周りの４つの領域とC3cerに特異的と思われる１つの領域が結合に関与している。また、シグナルスイッチであるRhoAではswitch I、interswitch, switch IIからなる約50アミノ酸領域がその結合に重要であった。この複合体結晶構造から次の結果が得られた。（１）C3と結合することで、RhoA(GTP）もRhoA(GDP)も、この結合領域が同じコンフォメーションをとり、どちらもADPリボシル化の基質になることができる。（２）C3のARTTループのGln183が,基質RhoAの修飾アミノ酸であるAsn41を認識することで、基質のアミノ酸の特異性を出していることが予想されてきたが、この構造から実験的に初めてC3 Gln183とRhoA Asn41が塩橋を作り、基質認識、すなわち修飾アミノ酸の選択をしていることを明らかにした。（３）さらに複合体の構造を基に酵素基質改変を行った。C3はRhoA特異的であり、同じRhoファミリーでAsn41を持つRac1やCdc42は良い基質とならない。Cdc42の結合部位の４つのアミノ酸に着目して４重変異体を作ることにより、C3cerの良い基質とすることに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
C3 enzymeは1989年の以来、そのRhoAに対する特異性から、Rhoシグナルカスケードを知るための重要な道具として用いられてきた。C3およびRhoAそれぞれ単体の構造解析はなされてきたが、多くの情報をもたらす複合体のX線結晶構造解析は長く期待されていたが、なされていなかった。この研究で、その複合体構造を明らかにした。特に重要な点は、RhoAとのタンパク質特異性と修飾されるアミノ酸の特異性を明らかにした点である。上記の結果を、Journal of Biological Chemistry誌（J Biol Chem. 7;290(32):19423-32. (2015)）に発表した。さらにEuropean Workshop on Bacterial Protein Toxins（ETOX17)で招待され口頭講演を行った。またC3とRhoAのお互いの認識するための構造柔軟性についてPathogen Disease誌（Pathog Dis. 73(9)(2015)）にレビューをまとめた。
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| 今後の研究の推進方策 |
C3-RhoA結晶を用いてNAD+をソーキングすることで結晶内でADPリボシル化させ、構造解析することは次の目標である。また、基質改変によりCdc42を良い基質に改変に成功しているが、次の目標はC3側の改変ができるかに興味がある。すなわち、Rac1やCdc42を認識してADPリボシル化する酵素に改変できないか探る。
既に我々は異なる特異性を持つADPリボシル化毒素Iaとactinの複合体の結晶構造解析に成功している。IaはアクチンのArg177特異的にADPリボシル化する。C3とIaの活性ドメインは非常に似た構造をしているが、その基質タンパク質と基質アミノ酸（修飾アミノ酸）は全く異なる。この２つの複合体Ia-アクチンとC3-RhoAの結晶構造を明らかにしたことでADPリボシル化の分子機構について多くの知見が得られた。現在ARTCファミリーで基質タンパク質複合体の構造はこの２つしか得られていない。今後、両者の類似点と相違点を詳細に検討していくことで、反応の類似性および違いを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の研究が予想以上に早く進み、論文掲載（JBC)およびタイムリーな国際学会（ETOX17)での発表につながった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度の研究をより発展させ、ADPリボシル化毒素の基質特異性と反応機構に迫る経費として用いて、オリジナリティのある研究を進めたい。
特にRhoAとC3の結合定数を測るためのラベリング試薬、ADPリボシル化を見るためのFITC試薬
に使用予定。また今までの研究成果を国際学会等で発表するために用いたい。
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