| 研究課題/領域番号 |
15K08291
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
香城 諭 国立研究開発法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, 上級研究員 (70360542)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | T細胞受容体Vα14Jα18 / NKT細胞特異的転写因子 / T細胞受容体遺伝子再構成 / クロマチン制御 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、NKT細胞特異的遺伝子再構成に際するクロマチン構造変化を捉え、その制御因子の同定の試みを通して、NKT細胞系列決定機構の一端を明らかにすることを目的とする。
1.細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変動
NKT細胞の核移植によって作成したNKTクローンマウスよりES細胞を作成し、NKT-ES細胞として使用した。OP9-DL1システムにてNKT-ES細胞からNKT細胞への分化誘導を行い、その分化過程におけるVα14領域のクロマチン構造変化の指標としてヒストン修飾をChIP-qPCR法にて確認した。その結果、初期状態ではヘテロクロマチン状態にあることが確認され、T細胞受容体α鎖の発現に伴いユークロマチン状態への変化が確認された。また、PcG複合体の主要構成因子の一つである分子AがNKT細胞の分化に必須であることが確認され、Vα14領域への分子Aの集積も確認されたことから、PcG複合体がNKT細胞分化に重要である可能性が示唆された。
2.Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定
NKT細胞において、Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子を同定するために、Vα14遺伝子配列を利用したDNAプルダウンアッセイを実施し、複数の結合タンパク質を同定した。また、Vα14プロモーター部位に特異的に結合配列が存在する転写因子群の存在も確認した。現在これらの候補制御因子について、CRISPR/Cas9をを利用しノックアウトマウスを作成中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
27年度研究計画に記載した「細胞分化に伴うVα14Jα18受容体遺伝子領域クロマチン構造の時間的変動」については順調に解析が進んでいる。クローンマウス由来LSK細胞よりiLS細胞を作成し使用する予定であった。iLSの誘導には成功したが、T細胞受容体遺伝子の再構成に起因すると考えられる分化促進が認められ、iLS細胞の特徴である未分化性の維持が困難であったため、使用を断念した。しかしながら、クローンマウスより樹立したES細胞を用いて本課題の進捗を得た。また、28年度以降の計画として記載した「Vα14Jα18受容体遺伝子再構成部位へ集積する制御因子の同定」について、一部同定が完了したため、上記区分を選択した。
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| 今後の研究の推進方策 |
同定した制御因子に対し、CRISPR/Cas9技術を用いてノックアウトマウスを作成し、Vα14Jα18遺伝子再構成、およびNKT細胞分化への関与を確認する。
NKTクローンマウス由来iLSの使用を断念したが、NKTクローンマウス由来NKT-ES細胞を用いてのNKT細胞分化誘導を可能としたため、これを用いてCRISPR/Cas9による遺伝子編集を実施する。遺伝子ノックアウトNKT-ESを作成すし、各遺伝子のNKT細胞分化への関与を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究室保有の試薬類にて効率的に研究を進捗させることが可能であった。次年度に予定しているノックアウトマウスの作成に大きな予算を必要とすることが想定されたため、次年度使用額として計上した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
・ノックアウトマウスの作成
・候補制御因子のさらなる同定
に使用予定。
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