研究課題
多くのタンパクコード領域からアンチセンスRNAが転写され、センスRNAと複合体を形成して様々な生物学的過程に関与していることが明らかとなってきた。しかし、癌形成能維持におけるアンチセンスRNAの役割、及びその分子機構については十分に明らかになっていない。我々は、卵巣癌において癌抑制遺伝子ANA/BTG3のアンチセンスRNAであるASBEL (antisense ncRNA in the ANA/BTG3 (three) locus) が、腫瘍形成能を制御していることを見出した。続いて我々は、大腸癌細胞においてβ-cateninによって転写制御されていること、及び転写因子であるTCF3と複合体を形成してATF3の発現を抑制することによって大腸癌の腫瘍形成能を獲得していることを見出した。本研究では、β-cateninがASBEL及びTCF3の発現を制御している生理的意義、及びASBEL-TCF3複合体が大腸癌の腫瘍形成能を維持する新規の分子機構を明らかにすることを目的として研究を進めてきた。現在までに、ATF3がASBELの発現を制御する機構を明らかにし、大腸癌細胞においてASBEL-ATF3経路にネガティブフィードバック機構が存在することを明らかにした。また、ASBEL-TCF3複合体がATF3の転写を制御する機構において、TCF3による標的遺伝子座の認識をASBELが制御していることを明らかにした。今後は、ANA/BTG3への影響や更なるASBEL-TCF3制御因子の同定を行い、lncRNAによる転写因子の機能制御が大腸がんの腫瘍形成能維持に関与する機構を俯瞰的に明らかにしていく。
1: 当初の計画以上に進展している
予備実験により、ATF3がASBELの発現を負に制御することを見出した。そこで、ATF3がASBELの発現を制御する分子機構を調べた。まず、大腸がん細胞に対してATF3抗体を用いたChIPアッセイを行い、ATF3がASBELのプロモーター上に結合していることを明らかにした。また、ATF3の発現を抑制すると、ASBELのプロモーター活性が上昇することが明らかとなった。ASBEL-TCF3複合体のターゲット遺伝子であるATF3の発現を抑制しておくと、ASBEL, TCF3の発現抑制によって引き起こされる腫瘍形成の抑制が緩和されることが明らかとなった。そこでASBEL-TCF3複合体によるATF3の発現制御機構を明らかにするために、ASBELによるTCF3の制御を確認した。結果、ASBELはTCF3量に影響しないことが明らかとなった。続いてChIP assayを行い、ASBELの消失によって、TCF3がATF3 locus上から離脱することを明らかにした。そこで、我々はTCF3のATF3 locusの結合領域にATF3のenhancer活性があると考え、TCF3結合領域を用いたレポーターアッセイを行った。ASBEL及びTCF3の発現を抑制すると、TCF3結合領域のレポーター活性が強く上昇することが明らかとなった。続いてIn vitroで合成したbiotin化ASBELをがん細胞にトランスフェクションし、pulldown アッセイを行った。結果、ASBELはATF3 locus上のTCF3結合領域に強く結合していることが明らかとなった。これらの結果より、大腸がん細胞において、ASBELはTCF3と結合することによってTCF3をATF3のゲノム上にリクルートし、ATF3の発現を抑制することによって、大腸がんの腫瘍形成能を維持していることが示唆された。
ASBEL-TCF3のANA/BTG3 RNAやタンパク質への影響、及び増殖に与える影響を確認する。RNA変化に関しては、転写制御、mRNA安定化の解析を行う。転写制御についてはChIP解析を行い、当該遺伝子座におけるTCF3の結合及びエピゲノム変化を確認する。RNA安定化制御については、TCF3とANA/BTG3 mRNAとの結合を調べ、miRNAの関与について解析を進める。タンパク質量に影響があれば、mRNA局在、翻訳機構、タンパク質安定化について解析を行う。さらに、腫瘍形成に必要なASBEL-TCF3の新規制御因子の同定をおこなうために、RNA-seq解析及びRNA screening を行う。さらに、MS解析で得られたTCF3結合タンパク質に着目してRNAi screeningを行い、ASBEL-TCF3依存的な細胞増殖制御機構に関与するタンパク質を同定する。続いて、当該因子のASBEL-TCF3による制御機構の解明を行うために、下流因子はChIP解析を行い、当該遺伝子座におけるTCF3の結合及びエピゲノム変化を確認する。結合タンパク質については、翻訳制御、安定化制御、局在制御などの観点から解析を続ける。
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すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 3件、 謝辞記載あり 3件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 2件) 備考 (1件)
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