| 研究課題/領域番号 |
15K08308
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
福田 信治 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70398238)
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| 研究分担者 |
東山 繁樹 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (60202272)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 乳がん細胞 / リン酸化酵素阻害剤 |
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| 研究実績の概要 |
リボソームS6キナーゼ (RSK)ファミリーに属するリン酸化酵素は、細胞増殖、及びその異常によるがん化において、重要な役割を果たすことが知られている。ただし、RSKが作用する分子基盤の詳細は依然として不明である。申請者はこれまでにヒト不死化乳腺細胞株MCF10Aにおいて、同メンバーのRSK2を発現抑制すると、細胞の特性が間葉様から上皮様に変換することを見出している。本研究では、遺伝子改変技術であるCRISPR/Cas9システムを用いて、RSK2を可視化できる乳腺細胞株を樹立し、RSK2の機能解析を行うことを目的とした。
当初、Vanderbilt大学の所属研究室にて樹立されたMCF10Aを用いて、RSK2遺伝子座に緑色蛍光タンパク質super folder GFP遺伝子を挿入する実験を行なっていた。しかし、MCF10Aの遺伝子導入効率が低いため、樹立することができなかった。そこで、遺伝子導入効率が高いMCF7へ細胞株を変更し、核移行シグナルを複数持つCas9を発現するレンチウイルスの構築も行なった。その結果、RSK2-GFP融合タンパク質を発現するMCF7の樹立に成功した。今後は共焦点顕微鏡によるライブイメージングを行い、増殖因子刺激後のRSK2の挙動を解析する予定である。合わせて、免疫沈降産物の質量分析によって、RSK2と相互作用する因子のスクリーニングを行い、細胞増殖制御の分子機構を明らかにする予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞株の樹立のために予想以上の時間を費やしたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
共焦点顕微鏡によるライブイメージングにより、増殖因子刺激後のRSK2の細胞内局在の解析を行う。またGFP抗体による免疫沈降を行い、共免疫沈降される因子の質量分析を行い、RSK2と相互作用する因子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画で購入予定にしていた抗体などの試薬について、多くを共同研究先負担で購入できたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今後の計画で新たに必要となる試薬の購入に充てる。
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