| 研究課題/領域番号 |
15K08330
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
涌井 敬子 信州大学, 学術研究院医学系, 講師 (50324249)
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| 研究分担者 |
河村 理恵 信州大学, 医学部, 助教(特定雇用) (20735534)
高野 亨子 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (70392420)
福嶋 義光 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (70273084)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / 1細胞解析 / 相同染色体 / RNA-FISH / X染色体不活化 |
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| 研究実績の概要 |
「RNA-FISH法による１細胞発現解析とエピジェネティックメカニズムに関する研究」は，ゲノムの一次構造の変化を伴わないエピジェネティックなメカニズムが関連遺伝子の発現に影響している，あるいは示唆されている特定の遺伝性疾患症例について，相同染色体を区別した遺伝子発現をRNA-FISH法により１細胞単位で解析することにより，新たな知見を得ることをめざしている．
１．XISTプローブのRNA-FISH解析
本年度は，Xpに部分欠失を有する2名の保因者女性を対象として，各細胞ごとに正常Xと異常Xのどちらが不活化されているかを解析し，いずれも構造異常のあるX染色体が優位に不活化されている結果を得た．また，X染色体不活化の制御に関連すると考えられているCTCF遺伝子の欠失を有する先天異常を伴う2女児例について，X染色体不活化の異常パターンの有無について解析し，異常パターンは確認されなかったという結果を得た．どちらもアンドロゲン受容体遺伝子解析により得た不活化パターン結果と矛盾しなかった．
２．PAX6プローブのRNA-FISH解析
無虹彩症の責任遺伝子として知られているPAX6の座位する11p13にひとつの切断点を有する均衡型転座症例について，昨年度，1)構造異常11番染色体にPAX6遺伝子の欠失は伴っていないこと，2)転座により構造異常11番染色体上のPAX6が分断されていないこと，3)サンガー法によるシーケンス解析にて対象症例のPAX6に病的シーケンスバリアントを認めないことを確認していた．本年度，無虹彩症の原因となりうるPAX6以外の遺伝子のシーケンスバリアントの確認のため，ターゲットエクソーム法による解析を進めている．なお，PAX6プローブのRNA-FISH解析については，Bリンパ芽球様細胞株で評価困難であることが確認されたため,皮膚線維芽細胞による検討を進めべく準備を開始した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．XISTプローブのRNA-FISH解析
XISTをRNAプローブとした3色RNA-DNA連続FISH解析法を，Xpに部分欠失を有する2名の保因者女性を対象として，各細胞ごとに正常Xと異常Xのどちらが不活化されているかX染色体不活化(XCI)パターン解析し，いずれも構造異常のあるX染色体が優位に不活化されている結果を得て，アンドロゲン受容体遺伝子解析により得たXCIパターン結果と矛盾がなかったことより，本解析法の有用性を確認した．
また，XCIの制御に関連すると考えられているCTCF遺伝子の欠失を有する先天異常女児2症例について，XCIの異常パターンの有無について解析し，異常パターンは確認されなかった結果を得て，CTCFの欠失はBリンパ芽球様細胞株ではXCIに影響を及ぼさないことが示唆された．おおむね順調に進展しているが，追加実験が必要となり論文作成が遅れている．
２．PAX6プローブのRNA-FISH解析
無虹彩症の責任遺伝子であるPAX6の座位する11p13にひとつの切断点を有する均衡型転座症例について，1)構造異常11番染色体にPAX6領域の欠失は伴っていないこと，2)転座により構造異常11番染色体上のPAX6が分断されていないこと，3)PAX6遺伝子に病的シーケンスバリアントを認めないこと，を確認していたが，さらに無虹彩症の原因となりうるPAX6以外の遺伝子の病的シークエンスバリアントの有無の確認のためのターゲットエクソーム解析を進めている．PAX6を含むDNAクローンを用いたRNA-FISH解析については,Bリンパ芽球様細胞株で発現を示すシグナルが非常に弱く，評価困難であることが確認されたため,異なる対象細胞として皮膚線維芽細胞による検討を進めるべく準備を開始した．PAX6プローブのRNA-FISH解析は，新たな解析戦略が必要となったことで予定より遅れている．
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで，ヒトゲノム解析に用いる対象細胞として一般的なBリンパ芽球様細胞株を用いて解析を進めてきたが，発現を確認するRNA-FISH法においては，解析対象遺伝子によっては適応とならないことを考慮する必要があることが再認識されてきた．
XISTプローブのRNA-FISH解析については，ゲノムバリアントを有する症例の結果も得て，アンドロゲン受容体遺伝子解析により得た不活化パターン結果と矛盾ないことも確認できたことで，RNA-FISH法による１細胞発現解析は有用性があるといえると考えているが，さらに再現性の確認と，対象症例を追加した解析を進めてゆきたい．
11p13に構造異常を有する無虹彩症症例のPAX6プローブのRNA-FISH解析については，Bリンパ芽球様細胞株では発現を示すシグナルが非常に弱く評価が困難であることが確認されたため,異なる対象細胞として皮膚線維芽細胞による検討を進めるべく準備を開始した．RNA-FISH解析結果の検証のために，別方法によるPAX6遺伝子の発現解析も必要になると考えており，異なる症例であるが11p13の部分欠失を有する無虹彩症の皮膚線維芽細胞を細胞バンクより入手し，罹患対象として用いるべく培養・保存した．今後，マイクロアレイ染色体検査によるPAX6が欠失範囲に含まれているかの確認，欠失範囲の同定を経て，PAX6遺伝子の発現解析における異常コントロールとしての利用を進める予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
XISTプローブのRNA-DNA連続FISH解析法について，国際誌への論文投稿のための英文添削や投稿費用や，国際学会での発表のための旅費などを考えていたが，再現性の確認のところで追加実験が必要になったことで，論文作成もまだ英文添削にいたっておらず，学会の演題締め切りにも間に合わなかった．実験の補助をしてもらうアルバイトも継続してもらうことができなくなり，その後適任者をみつけることができなかったことも，計画にやや遅れがでている要因となっている．研究分担者の経費が執行に至らなかったのも，実験計画の遅れによるものである．それらの経費が次年度使用額となった．
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| 次年度使用額の使用計画 |
H29年度請求額とあわせ，英文添削や投稿費用，さらに新たに計画している実験等に必要な消耗品など，必要な経費に振り分けて使用する．
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