2015 年度実施状況報告書

次世代シークエンシングによる骨軟部腫瘍特異的融合遺伝子検出の試み

研究課題

研究課題/領域番号	15K08389
研究機関	産業医科大学
研究代表者	久岡正典産業医科大学, 医学部, 教授 (40218706)
研究分担者	松山篤二産業医科大学, 大学病院, 講師 (80351021)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2018-03-31
キーワード	骨軟部腫瘍 / 滑膜肉腫 / ユーイング肉腫 / 粘液型脂肪肉腫 / RT-PCR / 融合遺伝子 / 次世代シーケンス
研究実績の概要	骨軟部腫瘍は発生頻度が低いにも関わらずその種類が多く分類が複雑です。骨軟部腫瘍の中には、それらの組織型に特徴的な融合遺伝子を有するものがあることが今日広く認識されており、それら融合遺伝子をRT-PCR法やFISH法で検出することは補助診断法として応用されています。しかし、未だ見出されていない融合遺伝子や既知の融合遺伝子のバリエーションは多数存在していると考えられており、それらを日常の病理診断の現場で用いられているホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織(FFPE)から見出すことのできる方法の開発が求められています。本研究では1)近年開発されている次世代シーケンス技術とFFPEを用いた融合遺伝子検出の実行可能性を検証するとともに、2)未知の融合遺伝子を見出し診断精度をさらに向上させることを目的としています。本年度は、主に上記1)の研究目的を中心に研究を進めています。複数の企業と本研究の実施のための方法・実行計画に関する話し合いや見積もりの結果、本学に設置されていない次世代シーケンス解析を北海道システムサイエンス社に委託して行うことといたしました。試薬のキットが高額であることに加え、解析も高額であるため初年度の予算で1)の研究目的に関する研究計画の解析を実行することは難しく、A.ライブラリ調整、B.次世代シーケンス解析、C.データ解析といった3段階の検索のうち、ABの解析を本年度に行い、Cは次年度の解析といたしました。融合遺伝子を有することが既に知られている腫瘍のサンプルとして、当初はユーイング肉腫や滑膜肉腫を想定していましたが、粘液型脂肪肉腫も主たる解析対象に加え、FFPE腫瘍組織からRNAを抽出して解析を進めています。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本年度は次世代シーケンス法を用いて骨軟部腫瘍のFFPEよりどの程度融合遺伝子を検出することが可能かを検証するための研究を行ってきました。まず、既に融合遺伝子を有することが確認されている骨軟部腫瘍を対象に症例を選択し、FFPEからRNAを抽出し解析することといたしました。解析を委託する北海道システムサイエンスとの協議の結果、手法としてはillumina社のRNA-seq法を選択し、費用の問題から10検体の解析を行う計画を立てましたが、FFPEからの解析は実績がほとんどないとのことで、新たな試みでした。FFPEから抽出された核酸は保存状態が不良である可能性があり、その場合、解析を進めることができない可能性があります。症例によっても核酸の保存状態は様々であることが予想されますので、解析に進める10サンプルに対し、FFPEからの核酸22検体、凍結腫瘍組織から抽出した核酸5検体を準備しました。解析には一定量の核酸濃度・量が必要ですが、核酸の保存状態が不良な検体があり、RNAサンプルの準備にやや時間を要しました。まずRNAサンプルの品質チェックを行いましたが、FFPEから抽出したもののうち7検体はRNAの保存状態が不十分で、解析可能と予想されたのは15検体でした。一方、凍結腫瘍組織から抽出した5検体は全て解析可能と予想されました。これらから、FFPEから抽出した9検体と凍結腫瘍組織からの1検体を解析対象として選択し、さらなる解析に進めました。ライブラリ調整は2検体では初回PCRにて充分なPCR産物の収量が得られませんでしたが、2回目までにはいずれの検体におきましても200ng以上のPCR産物が得られ、目的としている260bp付近にピークが見られ、解析可能となりました。Illumina HiSeqによる次世代シーケンス解析も終了しました。28年度の予算でデータ解析を進める予定です。
今後の研究の推進方策	既にシーケンスまで終了している検体は、今後データ解析、blast解析へと進め、融合遺伝子が検出されるかどうかを確認する予定です。これらの検体の次世代シーケンス検索の最大の目的は、FFPE組織検体からどの程度融合遺伝子が検出できるのかを確認するという点であり、10例中7例は既に通常のRT-PCR法で融合遺伝子の存在を確認しています。また2例（1組）は同一症例の凍結腫瘍組織ならびにFFPE両者からRNAを抽出し解析しているため、それらのデータの比較を行います。3例は融合遺伝子を有することが確認できていないが、そのうち2例はその組織型から検出されるであろう融合遺伝子のタイプは想定されています。残り1例は組織型の確定診断ができていない分類不能肉腫であるため、新たな融合遺伝子が検出される可能性があります。もし、新たな融合遺伝子が検出された場合、この症例を陽性コントロールとしてRT-PCRのプライマー設計・PCR条件設定をし、過去に融合遺伝子が検出されなかった症例のcDNAを対象にPCRを行う予定です。可能であれば、FISH法による検討も可能となるよう、probeなどに関しても条件設定いたします。これらの手法を用いて、過去の分類不能肉腫の症例を収集して対象となる症例を選択し、同一の融合遺伝子が検出される例はないか検討いたします。また、次世代シーケンス解析にてFFPEから抽出されるRNAを用いて融合遺伝子を検出することは十分可能であるという検索結果が得られたなら、これまでの検索にていずれの融合遺伝子も確認されていない分類不能肉腫10例を再び選択し、FFPEから同様にRNAを抽出して同様の過程で融合遺伝子探索のための研究を行っていく予定です。
次年度使用額が生じた理由	本研究を遂行するための解析手法として次世代シーケンス解析を用いますが、目下我々の所属施設には解析機器が設置されていないため民間企業に委託して解析を行う研究計画をたて、その解析の委託に必要な経費を研究経費として申請いたしました。本年度の本補助金の実際の使途としては、それらの経費のみです。研究はほぼ当初の予定通り遂行することができましたが、当初の予定よりも安価に解析を行うことができたため、66,600円を次年度使用額といたしました。
次年度使用額の使用計画	次年度使用額は、従来の助成金の経費と合わせ、次世代シーケンス解析のための経費として使用してまいります。今年度の助成金で解析中の検体のデータ解析のための経費として使用いたします。また、新たな融合遺伝子が見出されたなら、未だ確定診断に至っておらず融合遺伝子も見出されていない他の分類不能肉腫症例のFFPEを用いて、RT-PCR法やFISH法により当該融合遺伝子検出する試みを行っている予定ですが、そのような解析の費用としても用いる可能性があります。