| 研究課題/領域番号 |
15K08421
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
千葉 朋希 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00645830)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 非コードRNA / 炎症 / サイトカイン |
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| 研究実績の概要 |
ロングノンコーディングＲＮＡ（lncRNA）による制御が炎症性サイトカインの発現制御における新たな階層として注目されているが、その生理的意義は明らかではない。これまでに申請者は炎症性サイトカインの発現を転写レベルで制御する新規のlncRNAを同定しており、TALENに代表されるゲノム編集技術を応用した遺伝子改変マウスを申請者が新規に開発した安定発現に最適化したコドン置換TALENを用いて、①TALE人工転写因子トランスジェニックマウスによるlncRNAの発現制御、②タモキシフェン誘導型TALENによるコンディショナルノックアウトマウスを作製することで炎症制御における意義を明らかにすることはもとより、ゲノム編集技術を応用した新たな技術基盤の確立を目的とした。
平成２７年度はＴＡＬＥ人工転写因子およびタモキシフェン誘導型ＴＡＬＥの最適化を試みた。モデルとしてマウスIL-1βおよびTNFαの転写調節領域に特異的なＴＡＬＥを作製し、そのC末端側に転写活性化ドメインであるＶＰ１６やNF-kappaB p65の転写活性化ドメインを融合した。また、転写抑制因子であるSIN3aを融合することで転写抑制を試みた。その結果、ＶＰ１６を融合したＴＡＬＥ人工転写因子では効率的な転写活性化が見られた一方でp65転写活性化ドメインでは十分な活性化が誘導されないことを明らかにした。また、ＴＡＬＥ人工転写因子は転写開始点に近いほど効率的に活性化が誘導できることを明らかにした。
エストロゲンレセプター融合ＴＡＬＥ（ＥＲーＴＡＬＥ）のタモキシフェン依存的な活性の誘導を検証するためにＥＲーＴＡＬＥのC末端側にＶＰ１６を融合してタモキシフェンによる標的遺伝子の誘導を検証したところタモキシフェン非存在下においても標的遺伝子の活性化がある程度見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２７年度の研究においてＴＡＬＥ人工転写因子による効率的な転写誘導の転写活性化ドメインはＶＰ１６が有効であること、標的とする遺伝子の転写開始点に近いほど効率的であることを明らかにした。また、転写抑制因子の融合による標的遺伝子の発現抑制にも成功し、転写活性化因子および転写抑制因子としてＴＡＬＥ人工転写因子が有用であることを示すことができた。一方でタモキシフェン誘導型ＴＡＬＥはタモキシフェン非存在下においても標的遺伝子の一定程度の活性化が認められたため、ＴＡＬＥ分子の最適化によるタモキシフェン依存的な核移行の制御が必要であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ＴＡＬＥ人工転写因子によるロングノンコーディングＲＮＡの発現誘導をマウス細胞株であるRAW264.7細胞を用いて検証する。また、ＶＰ１６が転写活性化に有用であることが明らかになったため、ＶＰ１６をベースとしたより強力な転写活性化ドメインを他の転写因子の転写活性化ドメインとの融合することで創出する。これらの検証をもとにＴＡＬＥ人工転写因子を発現する遺伝子改変マウスを作製し、ロングノンコーディングＲＮＡの炎症病態への寄与を検証する。また、タモキシフェン誘導型ＴＡＬＥＮにおいてはタモキシフェン非存在下においても一部が核へ移行することで活性がリークすることが明らかになりつつあるため、ＴＡＬＥタンパク質の核移行シグナルを改変することでタモキシフェン添加に依存したより厳密な制御を検証していく。一方で、その代替策としてCRISPR/Cas9による遺伝子改変マウスの作製についても行なっていくこととする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画していた遺伝子改変マウスの作製が次年度以降に行うことになったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２８年度に遺伝子改変マウスの作製に必要なマウスの購入、遺伝子導入の委託、マウス系統の維持・管理費用として適切に執行する。
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