リン・カルシウム代謝異常による臓器線維化および血管石灰化の分子機構

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 15K08430
• 研究機関: 和歌山県立医科大学
• 研究代表者: 村垣 泰光 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (40190904)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 血管石灰化 / 酸化ストレス / オートファジー

研究実績の概要

本年度は培養大動脈平滑筋細胞に石灰化が生じる条件設定を確立することから開始した。培養液中のカルシウム濃度を０.6ｍMと2.0 mMに固定して、リン濃度を3 mMにまで増加した。これ実験により培養大動脈平滑筋細胞が安定して石灰化を起こす濃度をカルシウム2.0 mMとリン濃度2.7 mMとした。この条件で大動脈平滑筋細胞を培養後３日、７日、９日で培養細胞を固定して免疫組織化学を行うか、細胞からRNAを抽出してreal-time PCRを行った。また細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロットを行った。本研究では血管平滑筋細胞のリン誘導石灰化における、酸化ストレスとオートファジーとの関連について特に焦点を当て行った。酸化ストレスについてはKeap1とNrf2およびNrf2の下流遺伝子であるNQO1とHO1に着目した。またオートファジーに関してはLC3とp62に着目し、酸化ストレスとの関連について検索した。血管平滑筋細胞の石灰化の程度はアリダリンレッド染色およびvon Kossa染色の強さを指標として判断した。蛍光免疫組織化学では石灰化の程度が強くなるに従って細胞質のKeap1の染色性が低下した。同時にNrf2は細胞質から核内に移行し、核内で沈着する様子が窺えた。しかしながらreal-time PCRによるmRNA量の定量では有意な変動は認められなかった。またp62では石灰化と共にタンパク量の増加がみられた。今後p62とKeap1, Nrf2との関連を検索し、血管石灰化におけるオートファジーと酸化ストレスとのクロストークを解明していく予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

実験の条件が定まらず、基本的な条件設定からやり直す必要が生じたため、余分な時間を費やした。

今後の研究の推進方策

培養大動脈平滑筋細胞を用いた血管石灰化モデルにおいて、高リン刺激により細胞内で生じるオートファジーと酸化ストレスとの関連を検索していく。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額として56,241円生じたが、これは可及的完全に使い切るように努力した結果生じた少量の余剰金であり、特に特段の理由があるわけではない。

次年度使用額の使用計画

ウエスタンブロット用の他のタンパクを認識する抗体の購入に当てたいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] PRG4 expression in myxoid liposarcoma maintains tumor cell growth through suppression of an antitumor cytokine IL-24. (2017)
  • 著者名/発表者名: Oikawa K, Mizusaki A, Takanashi M, Ozaki T, Sato F, Kuroda M, Muragaki Y
  • 雑誌名: biochem Biophy Res Commun 巻: 485 ページ: 209-214
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.02.055
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Refractory Ascites with Liver fibrosis developed in late phase allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: report of three patients (2016)
  • 著者名/発表者名: Hosoi H, Warigaya K, Murata S, Mushino T, Kuriyama K, Nishikawa A, Tamura S, Hatanaka K, Hanaoka N, Muragaki Y, Murata S, Nakakuma H, Sonoki T.
  • 雑誌名: Hamatol Rep 巻: 8 ページ: 6482
  • DOI: 10.4081/hr.2016.6482
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] An autopsy case of fulminant amebic colitis in a patient with a history of rheumatoid arthritis (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawabe N, Sato F, Nagasawa M, Nakanishi M, Muragaki Y
  • 雑誌名: Case Rep Rheumatol 巻: 2016 ページ: 8470867
  • DOI: 10.1155/2016/8470867
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Acidic microenvironments induce lymphangiogenesis and IL-8 production via TRPV1 activation in human lymphatic endothelial cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakanishi M, Morita Y, Hata K, Muragaki Y.
  • 雑誌名: Exp Cell Res 巻: 345 ページ: 180-189
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2016.06.006
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Rhythmic expression of DEC2 protein in vitro and in vivo (2016)
  • 著者名/発表者名: Sato F, Muragaki Y, Kawamoto T, Fujimoto K, Kato Y, Zhang Y
  • 雑誌名: Biomed Rep 巻: 4 ページ: 704-710
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著