| 研究課題/領域番号 |
15K08465
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
竹村 太地郎 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (60572899)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 環境コレラ菌 / ゲノム解析 / CRISPR |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、Vibrio cholerae を解析対象として、環境中の水平遺伝子伝達による多様性獲得と形質変化、ならびに菌数制御機構へのCRISPR/Casの寄与を明らかにすることを目的とする。ゲノムデータベースより、約300株のV. choleraeゲノム情報を取得し、CRISPR/Cas領域の配列解析を行ったところ、これまでに見出していたタイプI－E（CRISPR_A）、タイプI-F（CRISPR_B）の他にタイプIII-Bに類似する型（CRISPR_C）を見出した。CRISPR_C特異的PCR系を構築してその分布を調べたところ、NAG株の2.8%(216株中６株)がこの型を持つことが明らかになった。また、ベトナム北部地域において環境水検体の収集とV. choleraeの検出・分離を行った結果、コレラ毒素（CT）遺伝子を持つ株は得られなかったがNAG株は約400株分離した。今後これらの分離株中のCRISPRタイピングとその標的配列の解析を全ゲノム解析を通じて進めると共に、その変動についての解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は（１）実験室保存株を用いたO抗原型別のCRISPR/Cas保有率と標的外来遺伝因子の解明、（２）ベトナム環境水由来V. choleraeの分離と全ゲノム配列の取得、の２小項目についての解析を進めた。（尚、（１），（２）とも平成２８年度以降にも継続する研究項目である。）
（１）については、これまでに見出していたCRISPR_A、_Bの他にタイプIII-Bに類似するCRISPR_Cが存在することを見出した。CRISPR_CはShewanella属細菌の有するCRISPRに近縁と考えられたが、その由来は未明である。CRISPR_CにコードされるCas遺伝子のうち、crm4、Cas6両遺伝子に対するプライマーを作成してO抗原型別のCRISPR_C保有率を解析し、非O1/O139株のうち約2.8%の株がCRISPR_Cを有することが明らかになった。CRISPR_A、_Bの保有率の解析は既に終わっており、_Cが一定数存在することは予想外ではあったものの、当初よりも良い結果になったと考えている。
（２）については２ヶ月おきにベトナム北部ナムディン省にて環境水の採集とPCRを用いた病原／非病原V. choleraeのスクリーニング、選択培養による分離を行った。主要病原因子であるctx遺伝子は全ての検体で見出すことができなかったが、O139-rfb遺伝子が２検体から見出され、うち１検体からO139株が分離された。次世代シークエンサーの所属研究室への輸送・設置がやや遅れたが平成２８年３月に設置が完了し、現在使用可能となっている。遅れは想定内の範囲と考えており、全ゲノム配列解析を今後進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画に大きな変更はない。（１）実験室保存株を用いたO抗原型別のCRISPR/Cas保有率と標的外来遺伝因子の解明に関しては、標的配列のデータベース化を行い、保有分布に関する論文を今年度作成する。（２）ベトナム環境水由来V. choleraeの分離と全ゲノム配列の取得に関しては、定期的なモニタリングを同地において継続し、手法等にも変更は予定していない。平成２７年度、２８年度に分離した菌株の全ゲノム解析を行い、コアゲノムの作製とファージ等の外来遺伝子配列の同定を行う。同時に、全ゲノム配列データを用いて（３）比較ゲノムによるベトナム分離株の系統学的解析、CRISPR/Casと水平伝達遺伝子、溶菌・抵抗因子の解析を開始する。研究協力者らによる他地域分離株との比較によってベトナム環境水中に循環するV. choleraeの遺伝学的特徴付けを行うとともに、その経時変化を解明する。
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