| 研究課題/領域番号 |
15K08466
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
後藤 正道 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 客員研究員 (80325779)
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| 研究分担者 |
鈴木 幸一 帝京大学, 医療技術学部, 教授 (20206478)
圓 純一郎 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 客員研究員 (30587879)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 抗酸菌感染症 / 末梢神経障害 / アポトーシス |
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| 研究実績の概要 |
1）線維芽細胞 （L929）へのmycolactone投与実験
線維芽細胞 （L929）へmycolactoneを投与して、細胞形態の変化、細胞膜破損の有無、アポトーシスの有無などの検討することで、先行研究の妥当性について確認した。M. ulcerans strain 1615から精製したmycolactone A/B（The University of Tennessee, USAのProf. Pamela Smallより供与）及び化学合成mycolactone A/B（ハーバード大学のProf. Yoshito Kishiより供与）を、L929に投与し、細胞障害を引き起こすmycolactoneの量を決めた。細胞障害の評価としては、形態学的観察、トリパンブルー染色による細胞膜傷害の定量、固定した細胞のTUNEL法によるアポトーシスの定量などを行った。
2）培養シュワン細胞(SW10)へのmycolactone投与実験
SW10へのmycolactone投与して、細胞形態の変化、細胞膜破損の有無、アポトーシスの有無などを検討し、L929への投与結果と比較した。細胞障害の評価としては、形態学的観察、トリパンブルー染色による細胞膜傷害の定量、固定した細胞のTUNEL法によるアポトーシスの定量などを行った。また、アポトーシスに関連したシグナル系の検出として、アポトーシス関連物質であるCaspase-3、Cleaved Caspase-3、PARPを用いて、①Western blotによるアポトーシスの検出、②蛍光抗体法によるアポトーシスの検出を行った。さらに、mycolactoneを投与しSW10の動態についての解析を行った。培養細胞標本を作成して、SW10の微細構造の変化などの細胞学的解析を行った。
実験結果からシュワン細胞がmycolactoneに高い感受性を示す傾向が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度の研究計画通り進行しており、現在までの経過について論文執筆に取り掛かっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）M. ulcerans及び他の抗酸菌による感染とmycolactone投与との比較
培養シュワン細胞・線維芽細胞にM. ulcerans及び他の抗酸菌（M. marinum、M. avium等）を感染させ、細胞内への菌の取り込み、細胞形態の変化、細胞膜破損の有無、アポトーシスの有無などを検討する。これらの結果と、mycolactoneによる培養細胞の変化との比較を行うにより、シュワン細胞と他の細胞の細胞障害パターンの違いを明らかにする。
2）Mycolactoneの細胞への侵入経路もしくは、受容体・シグナル伝達経路の同定
Mycolactoneの細胞への侵入経路もしくは、受容体・シグナル伝達経路を同定する。平成27年度の結果を元に、mycolactone により引き起こされる細胞動態の詳細な解析を行う。まず、蛍光標識したmycolactone を用いて、細胞への侵入経路や局在を明らかにする。また、DNAマイクロアレイ解析（Agilent Whole Rat GenomeオリゴDNAマイクロアレイ）による網羅解析を行い、末梢神経障害に寄与する遺伝子発現変化を明らかにする。候補となる遺伝子ついては、real time PCRによって確認するとともに、siRNA によるノックダウンを用いてその機能を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年3月にスイスのジュネーブで開催されるWHO会議への出席費用として予算を計上していたが、本年は会議が未開催であったため残金が生じた。
また、細胞及び試薬については前年度まで研究室で使用していたものが使用可能であったため新たに購入する必要がなく、平成27年度は物品費の支出が0であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年3月に開催されるWHO Annual Meeting of Buruliへの出席を予定しており、スイスへの渡航費用として使用予定である。
また本年度はDNAマイクロアレイ解析を行っていく予定であり、そのための外注費用として使用予定である。
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