| 研究課題/領域番号 |
15K08467
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
Toma Claudia 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40325832)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | レプトスピラ / 感染 / 尿細管上皮細胞 / 細胞死 |
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| 研究実績の概要 |
病原性レプトスピラは多くの哺乳動物に感染し、腎尿細管で増殖し尿中へと排出される。しかしながら、本菌の尿細管上皮細胞の感染機構はほとんど理解されていないのが現状である。本研究では、高病原性株（LP株）と人工培地にて継代を長期間繰り返すことによって病原性を失ったHP株を用いて、尿細管上皮細胞の感染戦略の違いを解析している。HP株で感染させた細胞では細胞死が誘導されるのに対し、LP株で感染させた細胞にはスピロヘータの形状を保持した菌が付着していることが分かった。従って、LP株は上皮細胞の細胞死を抑制し、菌が定着・増殖する足場を守っているという仮説を立てるに至り、本研究ではそのメカニズムを解明することを目的にしている。
平成27年度は、HP株が誘導する細胞死経路を同定するためにネクローシスやアポトーシスの阻害剤で細胞を前処理し、感染を行った。その結果、ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ-1（PARP-1）の阻害剤であるPJ34が細胞死を抑制することを認めた。PARP-1依存性細胞死（パータナトス：Parthanatos）ではミトコンドリアタンパク質であるアポトーシス誘導因子(apoptosis inducing factor, AIF)がミトコンドリアから放出され核内へと移動するため、AIFの挙動も調べた。その結果、HP株の感染においてはAIFは核内に移行することを蛍光免疫染色にて確認できた。また、HP株が誘導する細胞死はカスパーゼ－3非依存性であることも明らかになり、LP株はパータナトスを抑制する機構を備えていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度は、「高病原性株（LP株）の感染によって抑制される細胞死の解析」を目的とした。
細胞死の阻害剤を用いた感染実験においては、PARP-1依存性な細胞死であることが示唆され、現在細胞死におけるPARP-1やAIFの役割を遺伝子のノックダウンによって解析中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.細胞死を抑制する細菌側因子の同定：LP株とHP株のマイクロアレイ解析によって、HP株で発現が10倍以上ダウンレギュレートされている14個の遺伝子について解析を行う。先ずはこれらのタンパク質の欠損株の感染によって、細胞死の抑制が起きるかを調べる。細胞死の抑制効果が消失した株を得られなかった場合はトランスポゾン挿入変異株のライブラリーのスクリーニングを行い、細胞死を抑制できない株を単離する。次に、その株のゲノムのシーケンシングを行い、トランスポゾンの挿入部位を決定する。また、レプトスピラー大腸菌のシャトルベクターを用いて、当該因子をLeptospira biflexaに発現させ、細胞死の抑制効果を調べる。
2.細菌側因子と宿主標的因子の相互作用の解析：
同定された細菌側因子の宿主標的分子のスクリーニングを行うために、細菌側遺伝子の6xHis-taggedタンパク質を作製し、これらをベイト(餌)にして細胞抽出液を用いたプルダウンを行い、細菌因子に特異的に結合する宿主タンパクをLC/MS質量分析計により同定する。 標的分子に関する情報（リン酸化される、ユビチン化される、細胞内局在が変わる等）があれば、細菌因子との結合によるそれらへの影響を調べる。また、宿主標的因子のsiRNAによるノックダウンによりその機能を解析する。実際に標的分子の発現が低い細胞ではLP株の感染による細胞死抑制効果が消失するかどうか調べる。
3.細胞内シグナル伝達の解析：細菌因子と宿主標的因子の相互作用によって活性化される下流のシグナルを解析し、細胞生存促進性タンパク質や細胞死促進因子等の発現をLP株とHP株で感染させた細胞でqRT-PCRおよびウエスタンブロットにて定量化する。
4.細胞死を抑制する細菌側因子のin vivoの機能解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度同定したPARP-1依存性細胞死経路について、ノックアウト細胞は得られたものの、感染実験は未だ終えていない。次年度に野生型細胞とPARP-1及びAIFノックアウト細胞を用いた感染実験を行う予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度はHP株が誘導する細胞死がパータナトスであることを確定するために、PARP-1及びAIFノックアウト細胞の感染実験を行う。今年度生じた額はこれらの感染実験に必要な培地と抗体の購入に使用する予定である。
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