| 研究課題/領域番号 |
15K08472
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
山田 剛 帝京大学, 医真菌研究センター, 准教授 (80424331)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 痒み / 白癬 / 白癬菌 / プロテアーゼ / トリプシン |
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| 研究実績の概要 |
“痒み”は、代表的な皮膚真菌症である白癬における特徴的な臨床症状の一つである。痒みは複数の機構を介して発生すると考えられているが、未だ不明な点が多い。最近、マウスの掻き動作を指標に確立された痒みの動物評価モデルを基に、白癬における痒みの発生メカニズムが解析され、「皮膚表層の大部分を占めるケラチノサイトの膜にある受容体（Protease-activated receptor 2, PAR-2）が痒みの発生に関与していること」、そして「本症起因菌である白癬菌がPAR-2のポリペプチド鎖を特定の部位で切断し活性化させるトリプシン様の基質特異性を示すプロテアーゼを産生すること」などが報告された。本研究の最終目標は、白癬菌の感染に伴い、表皮ケラチノサイトに存在する膜受容体の活性化を介して発生する痒みのメカニズムの詳細を明らかにしていくことである。
上記の目標に到達するために、平成２７度を通じて、トリプシン様プロテアーゼの同定を進めてきた。主要白癬菌のゲノムシーケンスデータを利用して候補となる複数の遺伝子（trypsin-like serine protease, 以下AvTLSPとする）を選抜し、白癬菌Arthroderma vanbreuseghemiiを用いて遺伝子操作株を作出すると共に、AvTLSPのcDNAを単離して組換えタンパク質（rAvTLSPs）の作出を行っているところである。遺伝子操作株の作出、または酵母Pichia pastorisへcDNAを導入し特異的タンパク質の発現が確認できたものについては、酵素化学的解析を中心とする遺伝子操作株の表現型解析、組換えタンパク質の精製および活性・基質特異性の解析などを進めていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題の立案・申請に先立ち、複数の白癬菌のゲノムシーケンスデータなどに関する情報を利用してトリプシン様の基質特異性（アルギニンのC-末端側を切断する）を示すプロテアーゼの候補を検討し、可能性のある５個の遺伝子（AvTLSP1~５とする）を選抜した。本課題の採択後、選抜した遺伝子の更なるブラッシュアップを行い、３個のAvTLSP遺伝子について、遺伝子操作株の作出、そしてcDNAの単離および組換えタンパク質の作製に取り組んできた。概ね研究課題申請時の計画通りに実験は進んでおり、遺伝子操作株（破壊株および復帰株）の作出の他、cDNAの単離と組換えタンパク質作製のための宿主に選んだP. pastorisへの導入が終了しているものもある。得られた遺伝子破壊株については、酵素化学的表現型解析に移行できるものと考えられる。そして、cDNA を導入したP. pastorisについては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによる特異的発現産物の確認、タンパク質精製および活性・基質特異性の解析に移行できるものと考えられる。さらに、このような遺伝子工学的アプローチによる解析の他、同定を目指しているトリプシン様セリンプロテアーゼは白癬菌の菌体内に局在することものと予想されることから、A. vanbreuseghemiiの細胞抽出液を調製し、カラムクロマトグラフィーによるタンパク質精製を別途進めている。こうした多面的なアプローチによる解析を通じて、目的とするトリプシン様プロテアーゼが同定される確率が高まるものと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの進捗状況で述べた通り、平成２７年度中に解析を進めてきた３つのAvTLSP遺伝子について、概ね研究課題申請時の計画通り、遺伝子操作株（破壊株および復帰株）の作出、またはcDNAの単離とP. pastorisへの導入を行うことができた。平成２８年度以降は、作出した遺伝子操作株の酵素化学的表現型解析（プロテアーゼ活性に関する比較解析など）を行うと同時に、cDNA を導入したP. pastorisについて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによる特異的発現産物の確認、タンパク質精製および活性・基質特異性の解析を行う予定である。一方、別途進めているカラムクロマトグラフィーによる白癬菌トリプシン様プロテアーゼの精製について、精製レベルをさらに高めた上でN-末端アミノ酸配列解析などを行う予定である。これらの解析のもと、目的とするトリプシン様プロテアーゼの同定につながるデータが得られた場合には、マウス痒み評価モデル”を基に、組換えタンパク質、遺伝子操作株または精製タンパク質によるPAR-2活性化を介した痒みの誘導の有無の検証へと移行していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究課題の立案・申請に先だって、白癬菌のゲノムシーケンスデータなどの情報に基づいてトリプシン様プロテアーゼの候補となる遺伝子の検討を行い、５個のAvTLSP遺伝子を選抜したが、平成２７年度中に候補遺伝子の更なるブラッシュアップを行い、解析を行う遺伝子の候補を絞り込んだ。また、絞り込んだ遺伝子のcDNAを効率良く発現させ、組換えタンパク質を作製する上でより適切と考えられる宿主の検討を予備的に進め、メタノール資化性酵母であるP. pastorisを宿主として利用できることが判明した。その結果、概ね研究課題申請時に計画した通り、遺伝子操作株（破壊株および復帰株）の作出の他、cDNAの単離およびP. pastorisへの導入が終了しているものもあり、平成２７年度の研究にかかる費用を抑制することができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度（平成２８年度）においては、作出した遺伝子操作株の酵素化学的表現型解析を行うと同時に、cDNA を導入したP. pastorisについて、特異的発現産物の確認、タンパク質精製および活性・基質特異性の解析を行う予定である。一方、これまで予備的に進めてきたカラムクロマトグラフィーによるトリプシン様プロテアーゼの精製について、精製レベルをさらに高め、目的とするプロテアーゼの同定につなげていく予定である。これらの解析を通じて、目的とするプロテアーゼの同定につながるデータが得られた場合、”マウス痒み評価モデル”を用いたin vivoの解析へと移行していくことになる。このような研究課題を遂行するために、平成２７年度に生じた余剰分の費用を平成２８年度に申請する費用と併せて使用する予定である。
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