| 研究課題/領域番号 |
15K08476
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
塚本 健太郎 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (80434596)
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| 研究分担者 |
幸田 知子 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 助教 (80336809)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ボツリヌス毒素 / ボツリヌス神経毒素 / ボツリヌス菌 / 神経毒素 / エンドサイトーシス / 細胞侵入機構 / 細胞内局在 |
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| 研究実績の概要 |
ボツリヌス神経毒素の細胞内侵入機構および細胞内動態を明らかにするため、多能性胚性癌細胞株であるP19細胞を用いて、蛍光標識毒素あるいは受容体結合ドメインのリコンビナント蛋白の局在を調べた。前年度は、種々のエンドサイトーシス阻害剤を用いて、ボツリヌスC型毒素の細胞への侵入経路について検討したが、今年度は毒素の細胞内での局在性を調べるため、種々のエンドサイトーシスマーカーとの共局在の解析を行った。
初期エンドソームマーカーであるRab5、後期エンドソームマーカーであるRab7、リサイクリングエンドソームマーカーであるRab11と標識毒素との共局在を調べた結果、いずれのエンドソームマーカーとも一部共局在がみられたものの、毒素のほとんどはこれらマーカーとは異なる局在性を示した。これらのことから、ボツリヌスC型毒素は細胞侵入する際に独自のエンドサイトーシス経路をとることが予想された。次に、開口放出を阻害するために、細胞にD型毒素を24時間前処理し、その後C型毒素を添加して細胞内基質（Syntaxin-1, SNAP-25）の切断を調べた結果、毒素処理をした細胞と未処理の細胞では、Syntaxi-1、SNAP-25の切断の程度に差は見られなかった。D型毒素の前処理によって細胞内のVAMP-2は完全に切断されており、エクソサイトーシスは阻害されていることが予想されるが、この条件下においてもC型毒素の作用は影響を受けないことから、C型毒素はシナプス小胞リサイクリング非依存的に細胞内に取り込まれると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
C型毒素の細胞侵入経路および細胞内局在について解析を行い、クラスリンおよびカベオラ非依存的なエンドサイトーシス経路により細胞に取り込まれることを明らかにすることができた。現段階でのこれらの成果は、当初計画をおおむね達成しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
C型毒素の細胞内侵入機構について、さらに詳細な検討を進めていく。これまではP19細胞を神経細胞に分化させて実験に用いていたが、今年度はラット脳から調製した初代培養神経細胞を用いて、P19細胞でみられた毒素の取り込み様式が、初代培養細胞においても同様に認められるかどうか確認する。また、これまでの結果を論文にまとめて報告する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度は研究が比較的に順調に進んだため、当初計画より消耗品の購入が少なくて済み、物品費の使用額が当初計画より減少した。また、旅費についても研究分担者との打ち合わせ、試料の授受の回数が少なくて済んだこともあり、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度（平成29年度）は、初代培養細胞を用いたボツリヌスC型毒素の細胞内局在解析を主に進める。各種オルガネラマーカー等の抗体、蛍光試薬、イメージング用プレートなど消耗品の購入が多く必要となる。また、研究分担者との打ち合わせ、試料の授受も昨年度同様行い、C型毒素の研究成果を論文発表する。そのため、英文校閲費や論文投稿費も支出項目として必要である。
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