| 研究課題/領域番号 |
15K08487
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
川端 寛樹 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (60280765)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | Borrelia miyamotoi / 新興回帰熱 / 血清感受性 / Borrelia garinii |
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| 研究実績の概要 |
Borrelia miyamotoiの血清非感受性は，血清中の補体による殺菌機構に対する抵抗性に起因すると考えられている。そこで、3年計画の1年目である平成27年度には、この補体抵抗性を規定する遺伝子群の同定とその機序を明らかとするための基盤実験系の確立を試みた。
ボレリアの膜構造は大腸菌等と異なるため，大腸菌を用いたボレリア表層抗原の機能解析は極めて難しいとされる．このため，大腸菌backgroundでの血清耐性を付与するボレリア遺伝子の単離は困難が予想された．また，ヒト血清に感受性である株はBorrelia gariniiで多く見出されるが、B. gariniiで容易に遺伝子導入が可能な株の報告は無い．そこで本研究ではまず，ヒト血清感受性でかつ遺伝子導入が容易である株の樹立を試みた．ヒト血清感受性のボレリア株として、ヒト血清感受性のBorrelia garinii 8株(VS-BM株、VS-BP株、VS-DA株、Fis01株、Far01株、Far02株、HT59株、NT25株)を用い、大腸菌-ボレリアshuttle vectorであるpBSV2にて形質転換可能な株の選別を行った。その結果、上記8株中１株のみ形質転換可能である事が明らかとなった。また形質転換可能なHT59株のクローン化10株中、形質転換が可能であったのはHT59株由来のHT59G株のみであった。HT59G株はヒト血清に対して感受性であることが再確認されたことから、平成28年度以降は、B. miyamotoi推定表層抗原遺伝子のクローニングとHT59G株への形質転換、ヒト血清に対する感受性試験を進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度は「ヒト血清に感受性のBorrelia garinii株から、形質転換可能な株を探索すること」最大の目標として研究を行った。これは、１）B. gariniiと近縁種であるB. burgdorferi株では形質転換法が確立され、これを用いた種々の遺伝子についてその機能解析が行われているが、B. burgdorferi株は知られている範囲では全ての株でヒト血清に対して非感受性（＝耐性）であり、他ボレリア種の血清耐性メカニズム解析において、その研究ツールとして汎用性に乏しいことがネックとなっていたこと、２）ヒト血清に感受性のB. garinii株を用いた形質転換法開発が欧州を中心に試みられてきたが、極めて低効率の形質転換成功例が１例のみ報告されているだけで実用性に劣ることから、新たな研究プラットフォームとなるB. garinii株の樹立が全世界的に求められていた。
本研究では国内で分離された株を複数試験し、形質転換可能な株を１株見いだした。また、この株の内、一部のpopulationが何らかの変異から形質転換可能になっていることを見いだした。以上の成績をもとに、本研究で樹立したHT59G株を用い、平成28年度以降B. miyamotoiの血清耐性に関わる遺伝子の同定を開始できる状況になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、平成27年度に樹立したBorrelia garinii HT59G株を用い当所の予定通り、以下の研究を実施する。
１）Borrelia miyamotoi株の外膜抗原遺伝子の導入
B. miyamotoi 株のdraft genomeをもとに，常法に従い推定される外膜抗原遺伝子を抽出する．B. miyamotoi genomeはおよそ1.5Mbであり，このうち外膜抗原遺伝子は，およそ100と推定される．これら遺伝子を個々のprimerにより増幅後，付加した制限酵素配列により切断し，pBSV2上にcloningし，B. garinii HT59G株へ導入する．導入する遺伝子はBorrelia 属細菌で報告される遺伝子発現制御系の影響を受けにくいflagellin遺伝子(flaB)プロモーターにより発現させる．これら遺伝子発現はRT-PCRにより確認する．
２）形質転換株の表現型
得られたB. garinii形質転換株はヒト血清感受性試験を行う。ヒト血清感受性試験は40%ヒト血清，または非働化ヒト血清を用いて試験を行う。対象となるMock controlにはBorrelia burgdorferi flaB プロモーターのみ持たせたpBSV2を導入したB. gariniiを用いる．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
形質転換可能なボレリア株のスクリーニング数が予定より少なく済んだことから、当初よりも消耗品の使用量が減少した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究に必要な酵素類・キット類等を購入する。また研究成果を発表するための経費（国内外の学会等に参加するための費用等）として使用する予定である。
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