| 研究課題/領域番号 |
15K08613
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
山本 浩靖 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00631201)
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| 研究分担者 |
木原 進士 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20332736)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 高中性脂肪血症 / 自己抗体 |
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| 研究実績の概要 |
本研究で対象とした脂質異常症の中で、高中性脂肪血症に関連する様々な分子のうち、まずリポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）とアポリポタンパクＣ２（ａｐｏＣ２）に着目し、自己抗体の検出系の開発を試みた。我々はこれまでに免疫沈降―ウエスタン・ブロット法を組み合わせた方法で「免疫沈降された対象分子に付着する自己抗体の検出」を行い成功しているため、この方法を用いることとした。
はじめに、複数の市販の抗ＬＰＬ抗体を用いてリコンビナントＬＰＬが免疫沈降できるかを検討したが、調べた抗ＬＰＬ抗体はいずれもウエスタン・ブロット法による検出系には用いることができたものの、免疫沈降法には使用できなかった。次にａｐｏＣ２については、Ｓ社のヤギ抗ヒトａｐｏＣ２抗体は免疫沈降法、ウエスタン・ブロット法のいずれにも用いることができることが確認された。続いて、高中性脂肪血症症例と対照症例の血清を用いて免疫沈降―ウエスタン・ブロット法を行い、幾つかの高中性脂肪血症症例で抗ａｐｏＣ２自己抗体の存在が確認された。さらに、ＩｇＭのみを認める症例、ＩｇＧ・ＩｇＡ・ＩｇＭ全て存在する症例など、存在する免疫グロブリンのサブクラスは症例毎に異なっていた。
引き続いて、その抗体価を調べる目的でリガンド・ブロット法を用いた解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでにも、多数例を用いた自己免疫性高中性脂肪血症の調査は行われているが、診断法に用いている脂質代謝関連抗原が適切でないものが多く、診断の信頼性は疑わしいものが多い。今回、解析に用いた複数の高中性脂肪血症症例では、血清中に存在する内因性の抗原に自己抗体が付着していることを証明しており、自己免疫的機序を正しく証明できたものと考えた。そこで、様々な疾患に合併する高中性脂肪血症に於ける自己抗体陽性率を調査するため、臨床検体あるいは人間ドックでの検体を収集できる市中病院との連携を強化した。当該病院における倫理委員会での承認も得られ、現在は症例・検体を蓄積しているところである。
一方、現在行っている「リガンド・ブロット法」は従来から自己抗体検出法として用いられている方法であり、膜に転写されたリコンビナント蛋白を用いてウエスタン・ブロット法を行い、血清中に存在する自己抗体を検出する方法である。そこで、ＬＰＬやａｐｏＣ２にそれぞれＶ５やＦＬＡＧのようなエピトープタッグを施したリコンビナント蛋白の発現ベクターを作成した。このベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をリコンビナント蛋白の供給源として用い、リガンド・ブロット法を行っているが、ウエスタン・ブロットでのバックグラウンドが高く、解析が難しいことが問題になっている。現在は、使用する血清の希釈倍率やリコンビナント蛋白の使用量など、様々なパラメータを変更して最適な検出条件を検討している。
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| 今後の研究の推進方策 |
多数の臨床検体における自己抗体の存在の有無の判定や自己抗体価の定量を行うために、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法を開発する。現在行っているリガンド・ブロット法による血清中の自己抗体検出は、このＥＬＩＳＡ法開発の基礎になるため、リガンド・ブロット法を用いた抗体検出条件の最適化を図り、その条件をＥＬＩＳＡ法に応用する。また、リガンド・ブロット法ではリコンビナント蛋白を抗原としたものであるが、今回のＥＬＩＳＡ法ではこれ以外に、抗原の部分配列を有するペプチドの利用も検討する。特に、対象分子の機能ドメイン（他の分子との結合ドメインや酵素活性ドメインなど）に着目し、このドメインを中央に据えた１５－３０アミノ酸の配列を抗原ペプチドとして合成した後、この蛋白抗原・ペプチド抗原をプレートに固層化し、これに血清、標識二次抗体を次々に添加するＥＬＩＳＡ法の系を構築する。また、このような直接吸着法だけでなく、抗体を固層化したプレートを用い、内因性の抗原・付着している抗体を利用したサンドイッチ法や競合法についても検討する。系が確立できれば、脂質異常症を合併する自己免疫性疾患に於ける自己抗体陽性率の判定を行う一方、生活習慣病の一表現型としてのみ捉えられている「脂質異常症」における自己抗体陽性率も検討する。
さらに、分子生物学的手法を用いて、脂質代謝における自己抗体の役割を解明する。すなわち、中性脂肪の水解に関わる酵素活性に与える自己抗体の影響や、脂肪基質や酵素との結合に与える自己抗体の影響を調べる。
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