2017 年度実施状況報告書

日本人ポンペ病に対する新生児マススクリーニングおよびハイリスク群スクリーニング

研究課題

研究課題/領域番号	15K08619
研究機関	熊本大学
研究代表者	奥宮敏可熊本大学, 大学院生命科学研究部(保), 教授 (50284435)
研究期間 (年度)	2015-04-01 – 2019-03-31
キーワード	ライソゾーム病 / ポンペ病 / Ⅱ型糖原病 / 新生児スクリーニング / common mutation / スプライス異常 / 酸性α－グルコシダーゼ / 酸性マルターゼ
研究実績の概要	ポンペ病は、ライソゾームに存在する酸性α－グルコシダーゼ(AαGlu)の遺伝的欠損に起因した常染色体性劣性遺伝病で、Ⅱ型糖原病としても知られる疾患である。本症に対する根治療法として酵素補充療法が承認された現在では、早期診断・早期治療介入が非常に重要である。申請者は、これまで血液濾紙による新生児マススクリーニング法の開発を中心に研究を行ってきた。平成25年より申請者らが開発した新生児スクリーニングシステムを用いて、現在までに約10万例の新生児をスクリーニングし、13例の遅発型ポンペ病と思われる症例ならびに1例の乳児型と思われる症例を同定した。本症の発症頻度は4万～10万人に1人と考えられてきたが、それより約10倍の患者が潜在している可能性が示唆され、しかもその多くが遅発型であることが予想された。この成果は、原因不明の神経・筋疾患患者(成人)の中にポンペ病が含まれていることを強く示唆する結果である。そこで、筋生検材料から病理染色用として作製された筋凍結切片を用いて酵素診断法の確立を試みた。本法を用いて、約500例の確定診断がなされていない神経筋疾患の筋生検材料を対象にAαGlu活性を測定したところ、いくつかの症例で活性低下が認められたが、それらの多くが生検材料の凍結切片ではなく、ホルマリン固定された組織片であることが判明し、提供される試料自体に問題があることが判明した。そこで、これらの固定標本を判別するためにリファレンス酵素とライソゾーム酵素の一つであるβ－ヘキソサミニダーゼを同時に測定し、生検材料で非固定の試料であるかを確認したうえで、AαGlu活性を測定する方法の構築を行った。また、日本人ポンぺ病における新規common mutationを同定し、その変異がスプライス異常をもたらすこと、ならびに当該変異のアリール頻度が22％であることも明らかにした。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由平成28年4月の熊本地震により、実験装置・器具ならびに遺伝子解析用の培養細胞等の多くを失い、予定していた研究が著しく遅延した。その影響は平成29年度にも影響を与え、実験の遅延につながった。しかし、その中でも日本人ポンペ病の新たなcommon mutationを発見することができた。その遺伝子変異はAαGlu遺伝子のあるエクソンの3’末端に生じる単塩基置換であるが、その塩基置換によりアミノ酸は変化することのないナンセンス変異であった。しかし、エクソン/イントロン接合部の塩基置換ということで、スプライス異常を想定し、その患者由来の培養線維芽細胞を用いてcDNAを合成後、大腸菌でクローニングし、どのような発現産物が合成されているか解析を行った。その結果、明らかなスプライス異常を認め、正常のサイズの発現産物は0.4％に過ぎなかった。その結果から、この変異をもつ症例はAαGluの完全欠損ではなく極微量ではあるが正常のmRNAを有することが発症年齢３歳であることの傍証となった。この研究成果を受けて、当該遺伝子変異を同定するシステムを開発し、１６例の日本人ポンペ病を対象に、当該塩基置換の解析をおこなったところ、アリール頻度が22％であることが判明した。この実験結果により、当該遺伝子変異は日本人ポンペ病のcommon mutationであることが明らかとなった。これらのデータはオランダ王国のエラスムス大学医学部臨床遺伝学講座が管理するポンペ病データベースに追加され、全世界から閲覧できるよう公開されている。
今後の研究の推進方策	現在、進行中の日本人ポンペ病の新生児スクリーニングをさらに進めると共に、平成29年度の成果として、日本人ポンペ病の新たなcommon mutationの同定したことにより、当該common mutationと他の様々な変異とのコンパウンドヘテロ接合体の臨床像を解明する必要があるころから、発現実験等を用いて酵素機能との関連性を詳細に解析する必要がある。この発現実験で発現した片方のアリールに当該common mutationを持つ様々なバリアント酵素の解析は、ウエスタンブロッティングや申請者が特許出願済の細胞粗抽出液(ホモジネート)を用いた目的蛋白質(ポンペ病の場合はAαGlu酵素蛋白質)の高次構造の異常を検出することができる「キモトリプシン・アッセイ」を用いて、実施する予定である。
次年度使用額が生じた理由	理由平成28年4月の熊本地震により、実験装置・器具ならびに遺伝子解析用の培養細胞等の多くを失い、予定していた研究が著しく遅延した。その遅延は平成29年度に影響し、当初予定していた実験を行うことができず、研究費を予定していた実験に使用することができなかった。使用計画申請者らは、日本人ポンペ病の原因遺伝子である酸性α－グルコシダーゼ遺伝子上に新たなcommon mutationが存在することを明らかにした。今後は、このcommon mutationを片側のアリールに持つ様々なバリアント酵素の機能解析を行い、それらのバリアントと臨床表現型の関連性を明らかにする必要がある。これらの情報はデータベース化し、オランダ王国エラスムス大学医学部臨床遺伝学講座が管理するポンペ病データベースで公開できるよう、当該研究経費は使用する予定である。